Estudo do desempenho reprodutivo e da resposta imunológica em zebrafish (Danio rerio) alimentados com dietas enriquecidas com pólen apícola

Abstract

El polen de abeja es un producto natural recolectado de las plantas por las abejas y almacenado en la colmena mezclado principalmente con enzimas salivales. Es una fuente rica de diversos nutrientes, por lo que puede ser un excelente complemento alimenticio. Este producto ha sido descrito con múltiples propiedades beneficiosas, como efectos antimicrobianos, inmunoestimulantes y antioxidantes. El pez cebra Danio rerio es un pez teleósteo de agua dulce tropical, ampliamente utilizado como modelo experimental para estudiar la biología compleja de los vertebrados, ya que permite una fácil manipulación genética. La identificación de los mecanismos implicados en las respuestas fisiológicas de los peces sometidos a un tratamiento complementario con polen de abeja puede aportar información importante para la recomendación de este producto en la dieta de ésta y otras especies. El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar la adición de polen de abeja a la dieta del pez cebra, focalizando su efecto en la reproducción, los parámetros de crecimiento, la modulación intestinal y la respuesta frente al desarrollo tumoral. Los peces cebra adultos fueron alimentados con diferentes dietas, tres veces al día durante 60 días, en el mismo período utilizando alimento comercial, artemia y polen de abeja. Se analizaron semanalmente los siguientes parámetros reproductivos: número total de huevos, producción de huevos por hembra, tasa de viabilidad embrionaria a 72 horas tras la fecundación, tasa de supervivencia de larvas después de la exposición al virus de la viremia primaveral de la carpa, tasa de supervivencia larvaria después de la exposición a Salmonellae enterica serovar Typhimurium y análisis del reclutamiento de neutrófilos en larvas después de la herida en la cola. Después de esto, los peces de cada tratamiento fueron analizados en busca de aumento de peso y longitud, y se recogieron los intestinos para evaluar la microbiota intestinal a través del análisis metagenómico. Además, se determinó los niveles de mRNA del gen que cifra la proteína amiloide A (Saa) en los órganos abdominales de pez cebra y de intestinos, ya que esta proteína es producida en el intestino y el hígado y tiene efectos sobre las células inmunes y algunas bacterias inducen fuertemente su producción. Después de 120 días de dieta, se evaluó el crecimiento tumoral de los peces restantes de cada uno de los tratamientos después del procedimiento de alotrasplante con melanoma, una forma muy agresiva de cáncer de piel. Nuestros resultados muestran que la suplementación con polen de abeja no logró mejorar la producción de huevos y la viabilidad del embrión en los peces cebra reproductores. En cambio, la descendencia de los reproductores alimentados con dietas suplementadas con polen de abeja mostró una mayor supervivencia tras la exposición al virus y una mayor migración de neutrófilos a las heridas. Estos resultados indican que el polen de abeja puede influir en la inmunidad vertical a través de importantes mecanismos relacionados con la inmunidad de la descendencia en las primeras etapas de vida. La dieta de polen de abeja también reveló una abundancia microbiana intestinal diferente a nivel de familia, género y especie en comparación con los peces del grupo de control; e, inesperadamente, los peces alimentados con polen de abeja mostraron una mayor tasa de crecimiento tumoral y tumores de mayor tamaño. Aunque algunos estudios atribuyen al polen de abeja actividades antitumorales, principalmente experimentos in vitro, nuestros resultados muestran que este vínculo debería ser cuestionado.

Bee pollen is a natural product collected by bees from plants and stored in the hive mixed mainly with salivary enzymes. It is a rich source of various nutrients, so it can be an excellent dietary supplement. This product has been described with many beneficial properties, such as antimicrobial, immunostimulating and antioxidants effects, which reflects in possible therapeutic features for different pathological situations. As diet can be associated with animal performance and reproduction, microbiota modulation and potentially factor for cancer, this study aimed to analyze if dietary bee pollen addition could influence zebrafish parameters. The zebrafish Danio rerio is a teleost fish from tropical freshwater, widely used as an experimental model to study complex vertebrate biology using many genetic approaches. The identification of mechanisms involved in physiological responses of fish submitted to supplemental treatment with bee pollen can provide important information for the recommendation of this product in the diet of also other species. The present work aimed to study the addition of bee pollen to the zebrafish diet, focusing its effect on reproduction, growth parameters, intestinal modulation and response against tumor development. Adult zebrafish were fed with different diets, three times a day, in the same period (9:00, 12:00 and 15:00 h) using commercial feed, brine shrimp and bee pollen. The fish received the diets for 60 days and throughout this period were tested weekly for the following reproductive parameters: total number of eggs, egg production per female, embryo viability rate (72hpf), larval survival rate after exposure to Viremia Spring Carp virus, larval survival rate after exposure to Salmonella enterica serovar Typhimurium and analysis of neutrophil recruitment in larvae after tail wound. After this, fish from each treatment were analyzed for weight gain and increased length, and the intestines were collected to assess the intestinal microbiota through metagenomics analysis by sequencing the 16S rRNA gene, which enables the identification of bacterial diversity between samples. Also, serum amyloid A (saa) transcript levels from zebrafish abdominal organs and from separated intestines were analyzed, as the protein encoded by this gene is produced in the intestine and liver, has effects on immune cells and some bacteria strongly induce its production. After 120 days of diet, fish remaining from each of the treatments were evaluated for tumor growth after allotransplantation procedure with melanoma, a very aggressive form of skin cancer. Our results show that bee pollen supplementation failed to improve egg production and embryo viability in zebrafish breeders. Instead, the offspring of breeders fed with bee pollen supplemented diets showed longer survival upon virus exposure and higher neutrophil migration to wounds. These results indicate that bee pollen can influence vertical immunity through important mechanisms related to offspring immunity in the early stages. Bee pollen diet also revealed different gut microbial abundance at family, genus and species level compared with fish from control group; and, unexpectedly, fish fed with bee pollen showed higher tumor growth rate and larger tumor size. Although some studies attribute bee pollen with antitumor activities, mostly in vitro experiments, our results show that this link should be questioned. Due to its variable composition, the effects caused by bee pollen ingestion need deeper investigation before recommendation, as it can also vary between different species and physiological states.