Estudio del enzima Lacasa y sus aplicaciones en la industria alimentaria

Abstract

Lacasa es un enzima oxidasa presente en una gran diversidad de organismos, donde cumple una gran variedad de funciones biológicas, de las cuales pueden ser destacado su rol en el proceso de esclerotización de la cutícula de insectos. Este enzima interviene en una gran cantidad de procesos en la industria alimentaria, como biorremediación, desarrollo de métodos de medida o estabilización de bebidas. Esta tesis ha tenido como objetivo el desarrollo de un método analítico de la actividad de Lacasa sobre diferentes sustratos y el análisis de la cinética enzimática de Lacasa sobre los distintos estereoisómeros de 2-metoxifenol (guaiacol) y 2,6-dimetoxifenol (siringol), sobre catecolaminas de carácter farmacológico o relacionadas a las involucradas en el proceso de esclerotización de la cutícula de insectos, y sobre oleuropeina e hidroxitirosol implicados en procesos industriales de la oliva. Todos los estudios de Lacasa fueron realizados usando la especie modelo Trametes versicolor. En este sentido, un método cronométrico fue diseñado, desarrollado y validado para la medida de la actividad enzimática de Lacasa, que permitió determinar los parámetros de la cinética enzimática sobre los estereoisómeros de siringol y guaiacol, las catecolaminas L-dopa, L-epinefrina, L-norepinefrina, DL-isoprenalina, L-isoprenalina, DL-α-metildopa, L- α-metildopa y L-dopametilester, además de los compuestos oleuropeína e hidroxitirosol. Además de los parámetros cinéticos descritos, estudios de “docking” molecular realizados sobre las catecolaminas mencionadas, oleuropeina e hidroxitirosol, pusieron de manifiesto que Lacasa de Trametes versicolor establecía enlaces de hidrógeno en el C-4 con los residuos His-458 y Asp-206, e interacciones π- π con el residuo Phe-265 que facilitaban la unión de los sustratos en el bolsillo enzimático. Por último, se ha descrito como Lacasa de Trametes versicolor presentaba una afinidad de unión superior sobre oleuropeína e hidroxitirosol respecto otras enzimas oxidasas como tirosina y Peroxidasa. Esta tesis presenta un estudio básico de la cinética enzimática de Lacasa sobre diferentes sustratos de interés en la industria alimentaria, que permita avanzar en el estudio de futuras aplicaciones industriales de Lacasa como procesos de biorremediación para evitar la contaminación de materias primas de la industria alimentaria, la producción de insectos comestibles o el desamargado de las olivas.

Laccase is an oxidase enzyme presented in a great diversity of organisms, where it fulfills a great variety of biological functions, of which its role in the process of sclerotization of the cuticle of insects can be highlighted. This enzyme is involved in a large number of processes in the food industry, such as bioremediation, development of measurement methods or stabilization of beverages. The aim of this thesis was the development of an analytical method for laccase activity on different substrates and the analysis of the enzymatic kinetics of laccase on the different stereoisomers of 2-methoxyphenol (guaiacol) and 2,6-dimethoxyphenol (syringol), on catecholamines of pharmacological character or related to those involved in the sclerotization process of insect cuticle, and on oleuropein and hydroxytyrosol involved in olive industrial processes. All laccase studies were performed using the model species Trametes versicolor. In this sense, a chronometric method was designed, developed and validated for the measurement of laccase enzymatic activity, which allowed determining the parameters of the enzymatic kinetics on the stereoisomers of syringol and guaiacol, the catecholamines L-dopa, L-epinephrine, L-norepinephrine, DL-isoprenaline, L-isoprenaline, DL-α-methyldopa, L- α-methyldopa and L-dopamethylester, as well as the compounds oleuropein and hydroxytyrosol. In addition to the kinetic parameters described above, molecular docking studies performed on the aforementioned catecholamines, oleuropein and hydroxytyrosol, revealed that Trametes versicolor laccase established hydrogen bonds at C-4 with residues His-458 and Asp-206, and π- π interactions with residue Phe-265 that facilitated the binding of the substrates in the enzyme pocket. Finally, it has been described how Trametes versicolor laccase had a higher binding affinity for oleuropein and hydroxytyrosol than other oxidase enzymes such as tyrosine and peroxidase. This thesis presents a basic study of the enzymatic kinetics of laccase on different substrates of interest in the food industry, which allows to advance in the study of future industrial applications of laccase such as bioremediation processes to avoid contamination of raw materials from the food industry, production of edible insects or olive debittering.