Phylogenetic, molecular and functional characterization of prostaglandin receptors in teleost fish

Abstract

El sistema inmunológico de los peces teleósteos se ha estudiado durante décadas, pero a pesar de los importantes avances realizados, aún se desconoce mucho, especialmente en lo que respecta a la presencia y el papel de las prostaglandinas, como PGE2 y PGA2, y sus receptores. La dorada (Sparus aurata L.), un pez teleósteo marino de gran valor comercial en la acuicultura mediterránea, ha sido ampliamente utilizado para comprender mejor la respuesta inmune de los peces. El objetivo de esta tesis es avanzar en el conocimiento del papel de las prostaglandinas PGE2 y PGA2 y sus receptores en la respuesta inmune de la dorada. En el primer capítulo, un ortólogo de PTGER1, PTGER3 y PTGER4, y dos de PTGER2 (Ptger2a y Ptger2b) fueron identificados y caracterizados en dorada. El análisis in silico mostró que todos estos receptores poseían el dominio de organización de los receptores acoplados a proteína G, con la excepción de Ptger2b. Los correspondientes estudios in vivo revelaron que se expresaban en todos los tejidos examinados, observándose los niveles más altos de ARNm de ptger1 y ptger3 en el bazo y de ptger2a y ptger4 en la sangre. La infección bacteriana indujo los niveles más altos de ARNm de ptger2a, ptger3 y ptger4 en el exudado peritoneal (el sitio de inyección bacteriana). Además, los granulocitos y macrófagos acidófilos de riñón cefálico mostraron diferentes perfiles de expresión de ptger1, ptger2a, ptger3 y ptger4. Además, en los macrófagos, la expresión de los receptores se vio débilmente afectada por la estimulación con ADN bacteriano o con PGE2, mientras que en los granulocitos acidófilos la estimulación resultó en la regulación positiva de ptger2a y ptger4. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren diferentes roles para los receptores PGE2 de la dorada en la regulación de las respuestas inmunes. En el segundo capítulo hemos identificado Nr4a3 en dorada y demostrado que PGA2 regula in vitro las principales funciones de los fagocitos profesionales de esta especie. El receptor Nr4a3 de dorada reveló motivos altamente conservados con todos sus ortólogos de vertebrados, particularmente el dominio de unión al ADN y el sitio de sumoilación. El análisis de expresión mostró que nr4a3 se expresaba constitutivamente en macrófagos y se regulaba positivamente con PGA2 solo y combinado con ADN bacteriano. Es importante destacar que la adición de PGA2 disminuyó débilmente los niveles de transcripción de genes que codifican las citocinas interleucina-1b (Il1b), Il6 e Il10, mientras que su combinación con VaDNA promovió una inducción sinérgica de los niveles de mRNA de estos tres genes. Sin embargo, PGA2 no pudo regular los niveles de ARNm del gen que codifica el marcador de polarización M2 Mrc1. Por el contrario, PGA2 inhibió el estallido respiratorio de granulocitos acidófilos e indujo los niveles de transcripción de los genes que codifican Il1b e Il10. Finalmente, PGA2 pudo señalizar a través de la dorada Nr4a3 cuando se expresó ectópicamente en células HEK293. En conclusión, hemos demostrado por primera vez que PGA2 regula las principales funciones de los fagocitos profesionales de teleósteos y aportado evidencias de que puede señalizar a través de Nr4a3, allanando el camino para estudios in vivo con el fin de comprender el papel de esta prostaglandina y la Nr4a3. receptor en las respuestas inmunitarias de los peces.

The immune system of teleost fish has been studied for decades but, despite the important advances made, much is still unknown, especially concerning the presence and role of prostaglandins, such as PGE2 and PGA2, and their receptors. The gilthead seabream (Sparus aurata L.), a marine teleost fish of great commercial value in Mediterranean aquaculture, has been widely used for better understanding the fish immune response. The aim of this thesis is to advance our knowledge of the role of prostaglandins PGE2 and PGA2 and their receptors in the immune response of the gilthead seabream. In the first chapter, one ortholog of mammalian PTGER1, PTGER3 and PTGER4, and two of PTGER2 (Ptger2a and Ptger2b) were identified and characterized in gilthead seabream. In silico analysis showed that all these receptors possessed the organization domain of G protein-coupled receptors, with the exception of Ptger2b. The corresponding in vivo studies revealed that they were expressed in all the tissues examined, the highest mRNA levels of ptger1 and ptger3 being observed in the spleen and of ptger2a and ptger4 in the blood. Bacterial infection induced the highest mRNA levels ofptger2a, ptger3 and ptger4 in peritoneal exudate (the site of bacterial injection). In addition, head kidney acidophilic granulocytes and macrophages displayed different ptger1, ptger2a, ptger3 and ptger4 expression profiles. Furthermore, in macrophages the expression of the receptors was weakly affected by stimulation with bacterial DNA or with PGE2, while in acidophilic granulocytes stimulation resulted in the upregulation of ptger2a and ptger4. Taken together, these results suggest different roles for seabream PGE2 receptors in the regulation of the immune responses. In the second chapter we have identified Nr4a3 in gilthead seabream and shown that PGA2 regulates in vitro the main functions of professional phagocytes of this species. The gilthead seabream Nr4a3 revealed highly conserved motifs with all their vertebrate orthologs, particularly the DNA binding domain and sumoylation site. Expression analysis showed that nr4a3 was constitutively expressed in macrophages and was upregulated by PGA2 alone and combined with bacterial DNA. Importantly, PGA2 addition weakly decreased the transcript levels of genes encoding the cytokines interleukin-1 (Il1b), Il6 and Il10, while its combination with VaDNA promoted a synergistic induction of the mRNA levels of these three genes. However, PGA2 failed to regulate the mRNA levels of the gene encoding the M2 polarization marker mannose receptor C-type 1 (Mrc1). In contrast, PGA2 inhibited the respiratory burst of acidophilic granulocytes and induced the transcript levels of the genes encoding Il1b and Il10. Finally, PGA2 was able to signals through gilthead seabream Nr4a3 when ectopically expressed in HEK293 cells. In conclusion, we have shown for the first time that PGA2 regulates the main functions of professional phagocytes of teleosts and provided evidences that it may signals through Nr4a3, paving the way for in vivo studies in order to understand the role of this prostaglandin and the Nr4a3 receptor in fish immune responses.