MGRN1 como determinante de la integridad genómica y del fenotipo maligno de las células de melanoma

Abstract

Mahogunina (Mgrn1) es una E3-ubiquitina ligasa codificada por un gen cuyas mutaciones de pérdida de función dan lugar al ratón mahoganoide, caracterizado por un oscurecimiento del pelaje, neurodegeneración espongiforme y defectos cardiacos congénitos. Una de sus funciones conocidas es la regulación de la actividad del receptor de melanocortinas 1 (MC1R). El gen MC1R, el mayor determinante de la pigmentación cutánea y de la sensibilidad a la radiación ultravioleta, es muy polimórfico y algunas de sus variantes alélicas se asocian con melanoma. Además, da lugar a distintos transcritos, entre ellos una forma de ayuste alternativo, MC1R-203, con función desconocida. La influencia de Mgrn1 en la señalización del MC1R y su participación en tráfico endolisosomal, homeostasis mitocondrial, estrés oxidativo y orientación del huso mitótico, podrían contribuir al desarrollo de melanoma y/o a la modulación del fenotipo de los melanocitos malignos. Por ello, nos propusimos: i) caracterizar funcionalmente la isoforma MC1R-203, ii) estudiar el papel de Mgrn1 como modulador del fenotipo maligno en células de melanoma de ratón, iii) analizar el papel de MGRN1 como determinante de la agresividad del melanoma humano y iv) estudiar la base molecular de los efectos fenotípicos de MGRN1 en células de melanoma. Demostramos que MC1R-203 es minoritario respecto a la isoforma canónica (MC1R) en células HBL. Sin embargo, ambas isoformas presentaron una estabilidad intracelular similar en células HEK293T. Experimentos funcionales indicaron que MC1R-203 no estimuló eficientemente la vía del AMPc, pero activó normalmente la cascada de las ERK1/2. A diferencia de MC1R, MC1R-203 no indujo la ubiquitinación de β-arrestina-2 (ARRB2), una modificación dependiente de la formación de un complejo ternario MGRN1-MC1R-ARRB2, indicando que no actúa como andamiaje entre ARRB2 y MGRN1. El estudio de Mgrn1 como modulador del fenotipo en melanocitos (melan-a6) y células de melanoma (B16F10) de ratón indicó que la deficiencia de Mgrn1 (disminuida mediante silenciamiento génico transitorio con siRNA o anulada mediante CRISPR/Cas9) promueve un fenotipo caracterizado por mayor pigmentación, mayor número de dendritas y adhesión, menor movilidad celular y menor capacidad de colonización en pulmón. Además, mediante citometría de flujo observamos una progresión anómala del ciclo de células deficientes de Mgrn1, con mayor porcentaje de células en fase S, inestabilidad genómica y daño en ADN (evaluado principalmente mediante ensayos cometa). Estos resultados sugieren que Mgrn1 podría regular el fenotipo maligno y la integridad genómica de las células de melanoma murino. Para determinar si la expresión de MGRN1 podría actuar como factor pronóstico en pacientes de melanoma, analizamos datos públicos (TCGA) y muestras de pacientes junto con sus datos clínicos. Comprobamos que la expresión de MGRN1 es mayor en muestras de melanoma que en piel normal o nevi. Además, la incidencia de mutaciones en MGRN1 en muestras de melanoma es comparable a la de otros genes asociados a cáncer y una menor expresión de MGRN1 se asocia con mayor supervivencia. Estos resultados indican que MGRN1 podría ejercer un importante papel en la agresividad del melanoma humano. La base molecular de los efectos fenotípicos de MGRN1 se estudió en células de melanoma humano HBL. La depleción de MGRN1 alteró la progresión del ciclo celular y aumentó el daño en ADN. Mediante ensayos de hebra de ADN, comprobamos que la ausencia de MGRN1 incrementó el estrés replicativo, con aumento de horquillas de replicación atascadas y deficiente activación del eje ATR-CHK1. Ensayos de inmunoprecipitación de MGRN1 y aproximaciones proteómicas mostraron su interacción con CDK2 y RPA1. La ausencia de MGRN1 disminuyó los niveles de CDK2, y experimentos de inhibición selectiva de esta quinasa sugirieron que la interacción MGRN1-CDK2 contribuye a la respuesta normal al estrés replicativo al participar en la activación correcta del eje ATR-CHK1.

Mahogunin (Mgrn1) is an E3-ubiquitin ligase encoded by a gene whose loss-of-function mutations cause the mahoganoid mouse phenotype, mainly characterized by coat color darkening, spongiform neurodegeneration and congenital heart defects. One of the best-known functions of MGRN1 is the modulation of the melanocortin 1 receptor (MC1R) signaling. The MC1R gene, the major determinant of skin pigmentation and sensitivity to ultraviolet radiation, is highly polymorphic and some of its allelic variants are associated with melanoma. Furthermore, MC1R produces different alternative splicing transcripts, including a minority spliceoform, MC1R-203, with unknown function. The influence of Mgrn1 on MC1R signaling and its functions in endolysosomal trafficking, mitochondrial homeostasis, oxidative stress and mitotic spindle orientation, could contribute to the development of melanoma and/or to the modulation of the phenotype of malignant melanocytes. Within this context, we proposed the following objectives: i) to functionally characterize the MC1R-203 isoform, ii) to study the role of Mgrn1 as a modulator of the malignant phenotype of mouse melanoma cells, iii) to analyze the role of MGRN1 as a determinant of human melanoma aggressiveness and iv) to study the molecular basis of the phenotypic actions of MGRN1 in human melanoma cells. We found that MC1R-203 expression in HBL cells was much lower than that of the canonical form (MC1R). However, MC1R and MC1R-203 showed similar intracellular stability when transiently expressed in heterologous HEK293T cells. Functional experiments indicated that MC1R-203 did not efficiently activate the cAMP pathway, but stimulated normally the ERK1/2 cascade. Unlike MC1R, MC1R-203 was incapable of promoting β-arrestin-2 (ARRB2) ubiquitylation. Since this post-translational ARRB2 modification dependens on the formation of an MGRN1-MC1R-ARRB2 ternary complex, this suggested that the MC1R-203 spliceoform was unable to scaffold ARRB2 and MGRN1. The study of Mgrn1 as a modulator of the phenotype of normal mouse melanocytes (melan-a6) and melanoma cells (B16F10) indicated that Mgrn1 deficiency (decreased expression upon by transient silencing with siRNA or knockout by CRISPR/Cas9) promoted a differentiated phenotype with increased pigmentation, dendricity and adhesion, decreased motility, and low rates of lung colonization. In addition, we observed by flow cytometry that Mgrn1-deficient cells showed an increased percentage of cells in the S phase of the cell cycle and an impaired genome stability, with accumulation of DNA damage (mainly evaluated by comet assays). These results suggested that Mgrn1 could regulate the malignant phenotype of mouse melanoma cells. To determine whether MGRN1 expression could act as a determinant of prognosis in melanoma patients, we analyzed public data (TCGA) and patient samples along with their clinical data. The results indicated that i) MGRN1 expression is higher in human melanoma than in normal skin or nevi, ii) melanomas display a significant rate of mutations in MGRN1 comparable with other cancer-associated genes, and iii) low MGRN1 expression is significantly associated with higher patient survival. These results indicated that MGRN1 could play an important role as determinant of human melanoma aggressiveness. The molecular basis of the phenotypic effects of MGRN1 was studied in HBL human melanoma cells. Lack of MGRN1 in human melanoma cells led to aberrant cell cycle progression and increased DNA damage. DNA fiber assays showed that the absence of MGRN1 increased cellular replication stress, with accumulation of stalled replication forks and impaired activation of the ATR-CHK1 signaling axis. Immunoprecipitation assays and proteomic approaches showed the interaction of MGRN1 with CDK2 and RPA1. Downregulation of MGRN1 decreased the levels of CDK2, and experiments with a selective inhibitor of the kinase suggested that the MGRN1-CDK2 interaction contributed to the normal response to replicative stress by participating in the efficient activations of the ATR-CHK1 signaling axis.