Advances in swine embryo production and transfer

Abstract

OBJETIVOS: El objetivo de la Tesis consiste en la mejora de dos biotecnologías de la reproducción porcina, la producción in vitro de embriones (PIV) y la transferencia embrionaria (TE). La mejora de la PIV se ha centrado en la modificación de los protocolos actuales, tratando de reducir el problema de la polispermia durante la fecundación in vitro modificando los protocolos de criopreservación espermática, en mejorar las condiciones de cultivo mediante el uso de antioxidantes como la coenzima Q-10 o la N-(2-mercaptopropionil)-glicina (NMPG) y finalmente en el desarrollo de un medio de cultivo químicamente definido para la producción de embriones porcinos. Respecto a la TE, las investigaciones se han centrado en el papel de la hembra receptora, estudiando por un lado el ambiente inmunitario a nivel uterino mediante la evaluación de diferentes citoquinas en diferentes periodos de la gestación. Por otro lado, también se han evaluado los efectos de las infusiones de plasma seminal previas a la inseminación y su impacto sobre la gestación, valorando su posible uso en los programas de TE.

METODOLOGÍA: Para abordar los objetivos planteados se han llevado a cabo diferentes procedimientos experimentales. Entre las técnicas utilizadas se incluye el proceso completo de PIV, dividido en sus tres etapas esenciales de maduración in vitro de los ovocitos, fecundación in vitro de los mismos y su posterior cultivo in vitro hasta alcanzar el estadio preimplantacional adecuado; así como la técnica para la obtención de embriones a partir de cerdas donantes mediante procedimientos quirúrgicos. Mediante estas dos técnicas se han obtenido tanto embriones producidos in vitro como embriones derivados in vivo, cuya calidad ha sido analizada posteriormente mediante diferentes técnicas analíticas, como la tinción diferencial de blastocistos, la medición de los niveles de radicales libres y glutatión o mediante análisis del transcriptoma con técnicas como la q-PCR o los microarrays. Este tipo de técnicas también han sido empleadas para analizar el endometrio de cerdas donantes y receptoras, obteniendo las muestras mediante histerectomías.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Los resultados de los diferentes experimentos llevados a cabo han sido recogidos y publicados en un total de nueve artículos. Las conclusiones alcanzadas son las siguientes:

-Una alta dilución de los espermatozoides antes de la congelación aumenta la monospermia sin afectar a las tasas de penetración, aumentando así la eficiencia de la PIV porcina. -La suplementación exógena de la Coenzima Q10 en los medios de maduración y cultivo in vitro no mejorara los resultados de la producción de embriones in vitro, sin embargo, la suplementación del medio cultivo in vitro con el antioxidante NMPG si aumenta la producción de blastocistos. -El medio químicamente definido basado en la suplementación con el factor plaquetario 4 puede sustituir eficazmente al tradicional medio de cultivo indefinido suplementado con albúmina sérica bovina con una producción de blastocistos y un perfil transcriptómico similar entre ambos. -Los niveles de citoquinas expresados en el endometrio de las cerdas portadoras de embriones muestran un entorno inmune uterino desviado hacia un perfil antiinflamatorio en comparación con las cerdas receptoras 6 días después del inicio del celo. -Los bajos niveles endometriales del factor inhibidor de la leucemia durante el periodo de implantación en las gestaciones alogénicas pueden conducir a un entorno desfavorable para la supervivencia embrionaria. -Las infusiones de plasma seminal modifican el transcriptoma a nivel endometrial y embrionario y promueven el desarrollo y la calidad de los embriones mediante la expresión de genes relacionados con el desarrollo embrionario, la implantación y/o la inmunidad materna, entre otros; lo que hace de estas infusiones una herramienta prometedora para su uso en la industria porcina tanto en programas de inseminación artificial como de TE.

OBJECTIVES: The objective of the Thesis consists of the improvement of two biotechnologies in swine reproduction, in vitro embryo production (IVP) and embryo transfer (ET). The improvement of IVP has focused on the modification of current protocols, trying to reduce the problem of polyspermy during in vitro fertilization by modifying sperm cryopreservation protocols, the improvement of the culture conditions by using antioxidants such as coenzyme Q-10 or N-(2-mercaptopropionyl)-glycine (NMPG) and finally the development of a chemically defined culture medium for the porcine embryo production. Regarding ET, research has focused on the role of the recipient sows, studying on the one hand the immune environment at the uterine level by evaluating different cytokines at different periods of gestation. On the other hand, the effects of seminal plasma infusions prior to insemination and their impact on gestation have also been evaluated, assessing their possible use in ET programs.

METHODOLOGY: Different experimental procedures have been conducted to address the objectives set out. Among the most used techniques are included the IVP process, divided in its three essential stages of in vitro oocyte maturation, in vitro fertilization of the oocytes and their subsequent in vitro culture until reaching the adequate preimplantational stage; as well as the technique for obtaining embryos from donor sows by surgical procedures. Through these two techniques, both in vitro produced embryos and in vivo derived embryos have been obtained, whose quality has been subsequently analyzed by different analytical techniques, such as differential staining of blastocysts, measurement of free radical and glutathione levels or by transcriptome analysis with techniques such as q-PCR or microarrays. These types of techniques have also been used to analyze the endometrium of donor and recipient sows, obtaining the samples through hysterectomies.

RESULTS AND CONCLUSIONS: The results of the different experiments conducted have been compiled and published in a total of nine articles. The conclusions reached are the following:

-High sperm dilution before freezing increases monospermy without affecting penetration rates, thereby increasing the efficiency of porcine IVP. -Exogenous supplementation of Coenzyme Q10 in maturation and in vitro culture media do not improve in vitro embryo production results, however, supplementation of in vitro culture medium with the antioxidant NMPG increases blastocyst production. -Chemically defined medium based on platelet factor 4 supplementation can effectively replace traditional undefined culture medium supplemented with bovine serum albumin with similar blastocyst production and transcriptomic profile. -Cytokine levels expressed in the endometrium of embryo-bearing sows show a uterine immune environment biased toward an anti-inflammatory profile compared to recipient sows 6 days after the onset of estrus. -Low endometrial levels of leukemia inhibitory factor during the implantation period in allogeneic pregnancies may lead to an unfavorable environment for embryo survival. -Seminal plasma infusions modify the transcriptome at the endometrial and embryonic level and promote the development and quality of the embryos by expressing genes related to embryonic development, implantation and/or maternal immunity, among others; making these infusions a promising tool for use in the swine industry in both artificial insemination and ET programs.