Insects with forensic and agri-food implications : Fannia pusio (Diptera: Fanniidae) and Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae)

Abstract

La información reunida en esta tesis aumenta el conocimiento de dos especies con objetivos diferentes en entomología aplicada. Los resultados obtenidos en la Parte I aportan información que pone de manifiesto la utilidad potencial de Fannia pusio (Wiedemann, 1830) en entomología forense, mientras que los resultados de la Parte II abarcan información sobre Tenebrio molitor (Linnaeus, 1758), una especie recientemente aprobada para fines alimentarios. Esta información permitirá ampliar el conocimiento de la biología, ecología y etología de los insectos para su aplicación. Fannia es un género de dípteros perteneciente a la familia Fanniidae con aproximadamente 300 especies; son atraídos por la materia orgánica en descomposición presentando hábitos necrófagos, lo que arroja luz sobre cuestiones criminológicas. Además de la importancia jurídica, tienen interés médico y económico, ya que son capaces de causar miasis en animales domésticos y en el ser humano. Por estas razones, debe realizarse una correcta identificación a nivel de especie donde los análisis moleculares se complementan con estudios morfológicos. El código de barras de ADN emplea un fragmento de 658 pb del genoma mitocondrial (cox1), pero en ocasiones las secuencias de este fragmento pueden estar contaminadas con restos de ADN externos; como alternativa está el uso de regiones cortas e internas (mini-barcode). En este trabajo mostramos cómo un fragmento de 240 pb es capaz de identificar correctamente las especies del género Fannia que se recolectaron a través de un muestreo por toda la Península Ibérica. La identificación molecular mostró a F. pusio como la especie más abundante presentando mutaciones particulares que permiten diferenciar los haplotipos de los individuos del noreste y del sureste. Las secuencias disponibles en las bases de datos analizadas junto con los resultados de este trabajo sugieren que la especie es originaria de América y que posteriormente se introdujo en la Península Ibérica a través de Portugal, sufriendo una continua expansión de su área de distribución. La variación en la forma de una selección de caracteres corporales es evaluada mediante la Morfometría Geométrica empleando la cabeza como estructura innovadora. El sexo debe tenerse en cuenta como una covariable clave en este tipo de estudios, ya que Fannia, como muchos otros dípteros, tiene una estructura de cabeza sexualmente dimórfica, con machos holópticos y hembras dicópticas. Nuestros análisis proporcionan información morfológica significativa donde F. pusio muestra una clara variación morfométrica intraespecífica a lo largo de un eje este-oeste en toda la Península Ibérica. Un patrón similar se obtuvo de una colonia criada en laboratorio frente a muestras silvestres. Las peculiaridades de comportamiento que presentan los insectos pueden aportar información adicional para futuras investigaciones. La aplicación de la entomología en el ámbito forense se ha centrado especialmente en los primeros taxones colonizadores de cadáveres en la fase inicial de descomposición. Sin embargo, las especies que aparecen en fases más avanzadas pueden contribuir a ampliar los conocimientos, como es el caso de F. pusio. Además, tiene la capacidad de colonizar cadáveres enterrados, condición en la que los dípteros de mayor tamaño son incapaces de hacerlo. En este trabajo se estudia su comportamiento en un rango de temperatura desde los 5 ºC hasta los 40 ºC, y las longitudes de los diferentes estadios para calcular el intervalo post-mortem (PMI) mediante los diagramas de isomorfen e isomegalen. Los resultados mostrados ayudan, junto con la bibliografía existente de otras especies, a ampliar el conocimiento de la entomofauna que se da en las investigaciones forenses. Por otro lado, el gusano amarillo de la harina, o T. molitor, es un escarabajo de la familia Tenebrionidae que ha sido recientemente aceptado por La Agencia Europea de Seguridad Alimentaria como especie segura para alimentación. El incremento de la población y el uso de proteína en piensos de animales, hace que los insectos se conviertan en los principales candidatos como alternativa prometedora sostenible por su alto contenido en proteína, grasas saludables y fibra, y su bajo coste de producción en comparación con el ganado convencional. En este trabajo presentamos una propuesta de una granja de T. molitor donde se analizan las condiciones óptimas de cría, el manejo, el cálculo de la producción anual en las instalaciones y la viabilidad económica para conocer la rentabilidad del proyecto. Con el auge de las granjas de insectos, las anomalías antes desconocidas son cada vez más frecuentes. En nuestras instalaciones se ha observado un desarrollo incompleto de la metamorfosis dando lugar a adultos con malformaciones en abdomen y élitros. Tres de los genes implicados en la vía metabólica de la esclerotización y melanización (TH, AANAT1 y Lac2) se analizan mediante RT-qPCR, utilizando un gen de referencia previamente validado (Rps3), para determinar el nivel de expresión de estos genes. Se eligieron individuos anómalos con la misma malformación e individuos normales y se utilizaron como controles y se observaron diferencias significativas.

The information gathered in this thesis increases the knowledge of two species with different objectives in applied entomology. The results obtained in Part I provide information that highlights the potential usefulness of Fannia pusio (Wiedemann, 1830) in forensic entomology, while the results in Part II cover information on Tenebrio molitor (Linnaeus, 1758), a species recently approved for food purposes. This information will further the knowledge of insect biology, ecology and ethology for its application. Fannia is a genus of diptera belonging to the family Fanniidae with approximately 300 species; they are attracted to decaying organic matter and have a necrophagous habit, which sheds light on criminological issues. In addition to their legal importance, they are of medical and economic interest, as they are capable of causing myiasis in domestic animals and humans. For these reasons, a correct identification at species level must be carried out where molecular analysis is complemented by morphological studies. DNA barcoding uses a 658 bp fragment of the mitochondrial genome (cox1), but sometimes the sequences of this fragment can be contaminated with external DNA remnants; as an alternative, short, internal regions (mini-barcode) can be used. In this work we show the ability of a 240 bp fragment to correctly identify the species of the genus Fannia that were collected through sampling throughout the Iberian Peninsula. Molecular identification showed F. pusio as the most abundant species presenting particular mutations that allow us to differentiate haplotypes from north-eastern and south-eastern individuals. The sequences available in the databases analysed together with the results of this work suggest that the species originates from America and that it was subsequently introduced into the Iberian Peninsula via Portugal, undergoing a continuous expansion of its distribution area. Variation in the shape of a selection of body characters is assessed by Geometric Morphometry using the head as the innovative structure. Sex must be taken into account as a key covariate in such studies, since Fannia, like many other Diptera, has a sexually dimorphic head structure, with holoptic males and dichoptic females. Our analyses provide significant morphological information where F. pusio shows a clear intraspecific morphometric variation along an east-west axis throughout the Iberian Peninsula. A similar pattern was obtained from a laboratory-reared colony versus wild samples. The behavioural peculiarities of the insects may provide additional information for future research. The application of entomology in the forensic field has focused especially on the early colonising taxa of corpses in the initial phase of decomposition. However, species occurring at more advanced stages can contribute to further knowledge, as is the case of F. pusio. In addition, it has the ability to colonise buried corpses, a condition in which larger dipterans are unable to do so. In this work we study its behaviour in a temperature range from 5 ºC to 40 ºC, and the lengths of the different stages in order to calculate the post-mortem interval (PMI) using isomorphen and isomegalen diagrams. The results shown, together with the existing bibliography of other species, help to broaden the knowledge of the entomofauna occurring in forensic investigations. On the other hand, the yellow mealworm, or T. molitor, is a beetle of the family Tenebrionidae that has recently been accepted by the European Food Safety Agency as a food safe species. The increasing population and use of protein in animal feed make insects a prime candidate as a promising sustainable alternative due to their high protein, healthy fats and fibre content, and their low cost of production compared to conventional livestock. In this study we present a proposal for a T. molitor farm where optimal rearing conditions, management, calculation of annual production in the facilities and economic feasibility are analysed to determine the profitability of the project. Previously unknown anomalies are becoming more frequent with the rise of insect farms. In our facilities, incomplete development of metamorphosis has been observed, resulting in adults with malformations in the abdomen and elytra. Three of the genes involved in the metabolic pathway of sclerotization and melanisation (TH, AANAT1 and Lac2) are analysed by RT-qPCR, using a previously validated reference gene (Rps3), to determine the expression level of these genes. Abnormal individuals with the same malformation and normal individuals were chosen and used as controls and significant differences were observed.