Comparación de dos métodos para la cuantificación de acilcarnitinas mediante espectrometría de masas en tándem en muestras de sangre impregnadas en papel para el diagnóstico de los defectos de la β-oxidación mitocondrial de los ácidos grasos

Abstract

El principal objetivo de los Programas de Cribado Neonatal (PCN) es la identificación de recién nacidos (RN) con enfermedades graves antes de la aparición de los síntomas y para las cuales existe un tratamiento efectivo que evitaría graves consecuencias sobre el RN. Los avances tecnológicos han permitido la implantación de la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) en los PCN permitiendo la detección, entre otros, de los defectos de la β-oxidación de los ácidos grasos (DOAG), los cuales son errores congénitos del metabolismo (ECM) con herencia autosómica recesiva. La detección precoz de estos desórdenes se realiza mediante la cuantificación de acilcarnitinas en muestras de sangre impregnadas en papel y permite la instauración de tratamientos a edades tempranas que mejoran su pronóstico. Metodología: Se utilizan dos metodologías basadas en la MS/MS. En una de ellas se realiza la derivatización (butilación) de las acilcarnitinas extraídas del soporte papel mediante solución extractora, mientras que la otra consiste en la cuantificación de las acilcarnitinas directamente tras el proceso de extracción. Nuestro laboratorio ha utilizado ambos métodos: uno basado en la derivatización de las acilcarnitinas, utilizándose un espectrómetro de masas modelo API 3200 y otro, basado en el método sin derivatizar y en el que las mediciones se realizaron en un espectrómetro de masas modelo TQD. Resultados: La primera parte de este trabajo consiste en comprobar la validez de ambos métodos para la cuantificación de acilcarnitinas en muestras de sangre impregnadas en papel (S&S 903). Para ello se analizan muestras de papel de filtro S&S 903 sin impregnar y controles de calidad pertenecientes al Newborn Screening Quality Assurance Program del Center for Disease Control and Prevention. Se comprueba que mediante el método con derivatización se obtienen límites de detección y cuantificación más elevados, una mayor sensibilidad y una peor precisión, en comparación con el método sin derivatización. En cuanto al sesgo, el método con derivatización, en general se obtienen valores superiores al valor de referencia mientras que, cuando no se derivatiza, los resultados son inferiores, con excepción de la C0. Los coeficientes de determinación obtenidos por ambos métodos son estadísticamente iguales y superiores a 0,99. La correlación entre ambos métodos de trabajo es fuerte y se ajusta a un modelo de regresión lineal. En la segunda parte del presente estudio se han estudiado los resultados de 167.563 RN procedentes de la Región de Murcia y de la Ciudad Autónoma de Melilla cuyas muestras de sangre impregnadas en papel se recibieron entre el 09/02/2007 y el 28/01/2016. Se comprueba que todas las acilcarnitinas tienen una dependencia respecto de la edad del RN a la que las muestras fueron tomadas. En general, todas las acilcarnitinas muestran una buena estabilidad salvo C2 y C3. Asimismo, las concentraciones de la mayoría de las acilcarnitinas presentan una dependencia respecto del peso del neonato en el momento del nacimiento, así como del tipo de alimentación (materna o artificial) del RN en el momento de la toma de la muestra. Todos estos resultados son independientes del método utilizado para cuantificar las acilcarnitinas. Durante el período de estudio se detectaron a 13 pacientes con DOAG confirmados mediante estudios moleculares: 2 CUD, 4 SCADD, 3 MCADD, 1 VLCAD, 2 LCHADD y 1 MADD, rindiendo una incidencia global de 1/12.889. Conclusión: ambos métodos son igualmente válidos para ser utilizados en un PCN destinado a la detección precoz de los DOAG, presentando cada método ventajas e inconvenientes respecto al otro, los cuales tendrán que ser tenidos en cuenta por los laboratorios que las quieran implantar. La capacidad diagnóstica de ambas técnicas para la detección de ECM relacionados con los DOAG son similares.

The main objective of the Neonatal Screening Programs (PCN) is the identification of newborns (NBs) with serious diseases before the appearance of symptoms and for which there is an effective treatment that would avoid serious consequences on the NB. Technological advances have allowed the implementation of tandem mass spectrometry (MS/MS) in PCN, allowing the detection, among others, of defects in the β-oxidation of fatty acids (DOAG), which are congenital errors of metabolism (ECM) with autosomal recessive inheritance. The early detection of these disorders is carried out through the quantification of acylcarnitines in blood samples impregnated on paper and allows the establishment of treatments at an early age that improves their prognosis. Methodology: Two methodologies based on MS/MS are used. In one of them, the derivatization (butylation) of the acylcarnitines extracted from the paper support is carried out by means of an extractor solution, while the other consists of the quantification of the acylcarnitines directly after the extraction process. Our laboratory has used both methods: one based on the derivatization of acylcarnitines, using a mass spectrometer model API 3200 and another, based on the underivatized method and in which the measurements were made in a mass spectrometer model TQD. Results: The first part of this work consists of checking the validity of both methods for the quantification of acylcarnitines in blood samples impregnated on paper (S&S 903). For this, samples of unimpregnated S&S 903 filter paper and quality controls belonging to the Newborn Screening Quality Assurance Program of the Center for Disease Control and Prevention are analyzed. It is found that the method with derivatization results in higher detection and quantification limits, greater sensitivity and poorer precision, compared to the method without derivatization. Regarding bias, the method with derivatization, in general values are obtained higher than the reference value while, when it is not derivatized, the results are lower, with the exception of C0. The coefficients of determination obtained by both methods are statistically equal to and greater than 0.99. The correlation between both work methods is strong and fits a linear regression model. In the second part of this study, the results of 167,563 NBs from the Region of Murcia and the Autonomous City of Melilla were studied, whose blood samples impregnated on paper were received between 02/09/2007 and 01/28/2016. It is found that all acylcarnitines have a dependence on the age of the NB at which the samples were taken. In general, all acylcarnitines show good stability except C2 and C3. Likewise, the concentrations of most acylcarnitines are dependent on the weight of the newborn at birth, as well as the type of feeding (maternal or artificial) of the NB at the time of taking the sample. All these results are independent of the method used to quantify acylcarnitines. During the study period, 13 patients with DOAG confirmed by molecular studies were detected: 2 CUD, 4 SCADD, 3 MCADD, 1 VLCAD, 2 LCHADD and 1 MADD, yielding an overall incidence of 1/12,889. Conclusion: both methods are equally valid to be used in a PCN intended for the early detection of DOAG, each method presenting advantages and disadvantages with respect to the other, which will have to be taken into account by the laboratories that want to implement them. The diagnostic capacity of both techniques for the detection of ECM related to DOAGs are similar.