El oviducto : análisis transcriptómico, identificación de proteínas secretadas y aplicaciones en reproducción artificial

Abstract

El oviducto es la región anatómica del tracto genital femenino que conecta el útero y los ovarios. Este órgano juega un papel importante en el transporte de gametos y su almacenamiento, incluyendo el reservorio espermático. Además, en él tienen lugar la fecundación y las primeras fases del desarrollo embrionario. En la primera parte de este trabajo se planteó una técnica que permite la separación de subpoblaciones de espermatozoides porcinos en función de su afinidad por azúcares relacionados con el reservorio espermático y se evaluó la capacidad de unión de estos espermatozoides por la zona pelúcida (ZP), para evaluar el potencial de esta selección en técnicas de reproducción asistida. En la segunda parte de la tesis, se llevó a cabo un estudio de transcriptómica del oviducto de la coneja antes y después de la ovulación y durante el desarrollo embrionario preimplantacional para identificar factores clave en cada una de estas etapas. Se empleó la separación celular mediante citometría de flujo (sorting) para seleccionar las subpoblaciones espermáticas porcinas pre-incubadas en medio no capacitante con ovalbúmina y el trisacárido Lewisa fluorescentes. La afinidad por la ZP se evaluó mediante incubación en medio capacitante de cada subpoblación espermática y su correspondiente control con ZPs aisladas a partir de ovocitos aspirados de ovarios obtenidos en matadero. La cantidad de espermatozoides unidos a la ZP se evaluaron con ayuda de Hoescht 33342 mediante microscopía de fluorescencia. Las diferencias temporales en el transcriptoma del oviducto se evaluaron mediante análisis de micromatrices y RT-qPCR, haciéndose las correspondientes preparaciones inmunohistoquímicas y análisis de proteínas secretadas al fluido oviductal (FO) mediante western blot. Los resultados de la primera parte muestran que se puede separar subpoblaciones espermáticas en función de su afinidad por sondas glucídicas, y que estas poblaciones tienen diferente afinidad por la ZP, lo que les confiere diferente capacidad para fecundar un ovocito. Los resultados del análisis mediante micromatrices muestran un total de 602 transcritos diferencialmente expresados entre las etapas analizadas (pre-ovulatoria, post-ovulatoria, oviducto con embriones de ocho células y oviducto con mórulas). Además, se identificaron tres proteínas del (FO) con una expresión diferente durante las etapas estudiadas: la osteopontina (SPP1), cuya expresión es mayor en la etapa post-ovulatoria (en presencia de zigotos); el neuropéptido Y (NPY), secretado antes de la ovulación; la metalopeptidasa 7 (MMP7), que deja de expresarse en las últimas fases del desarrollo pre-implantacional. Como conclusiones de la primera parte de la tesis: 1) existen varias subpoblaciones espermáticas con distintas afinidades por azúcares que poseen diferente afinidad por la ZP, 2) es posible separar las subpoblaciones espermáticas en base a su afinidad por glicoconjugados mediante sorting, pero su afinidad por la zona pelúcida se compromete, 3) es necesario implementar un método de separación diferente al de sorting que no disminuya la afinidad de los espermatozoides por la zona pelúcida. En cuanto a la segunda parte de la tesis: 1) el transcriptoma del oviducto de la coneja presenta diferencias espaciales y temporales durante la ovulación y el desarrollo embrionario pre-implantacional; 2) Varias proteínas del FO varían entre la cópula y el final del desarrollo embrionario pre-implantacional, incluyendo SPP1, NPY y MMP7; 3) La respuesta a la ovulación y la cópula presenta ciertos mecanismos moleculares conservados entre diferentes especies de mamíferos, favoreciendo la expresión de SERPINE1, SPP1 y PTGS2; 4) La respuesta del oviducto de los mamíferos a la presencia de embriones involucra una modulación local del sistema inmune. Aún así, no se ha esclarecido un mecanismo de respuesta universal debido a la discrepancia de resultados entre especies.

The oviduct is the anatomical region of the female genital tract which connects the utherus with the ovaries. This organ plays a relevant role in gamete transport and storage, including the sperm reservoir. Moreover, fecundation and the first stages of embryo development take place in the oviduct. In the first part of this thesis, a technique on boar spermatozoa separation was developed on the bases of affinity for sugars involved in the sperm reservoir. A study on the ability of these spermatozoa to bind the zona pellucida (ZP) was done to evaluate a possible use on assisted reproduction techniques. In the second part of the thesis, a transcriptomics study of the oviduct of the rabbit doe was performed before and after ovulation, and during the preimplantational embryo development to identify key factors of each stage. Among the experimental techniques used, there was flow cytometry cell sorting to select the sperm subpopulations pre-incubated with fluorescent ovalbumin and the sugar Lewisa. Affinity for ZP was evaluated by incubating in capacitating medium each sperm subpopulation and its correspondent control with isolated ZPs from oocytes obtained from ovaries of a local abatoir. The quantity of sperm bound to the ZP was evaluated with Hoescht 33342 by fluorescence microscopy. The temporal differences in the transcriptome of the oviduct were evaluated by microarray analysis and RT-qPCR, doing the correspondent immunohistochemistry techniques. The analysis of secreted proteins to the oviductal fluid (OF) by western blot. Results show that it is possible to separate sperm subpopulations based on their affinity for sugar probes, and these subpopulations have a different affinity for the ZP, so they have a distinct fertilization potential. Microarray analysis show 602 transcripts differentially expressed between the analysed stages (pre-ovulatory, post-ovulatory, 8-cell containing oviduct and morulae containing oviduct). Furthermore, three oviductal proteins with a differential expression during the analysed stages were identified: osteoponting (SPP1), whose expression is highest in the post-ovulatory stage; neuropeptide Y (NPY), secreted before ovulation; metallopeptidase 7 (MMP7), whose expression is repressed during the last stages of pre-implantational development. To conclude with the first part of the thesis: 1) there are several sperm subpopulations with different affinities for sugars which have different affinities for the ZP, 2) it is feasible to separate these sperm subpopulations by flow cytometry cell sorting, but its affinity for the ZP is compromised, 3) it is mandatory to implement a method of sperm selection not involving sorting in order to avoid disminishing the affinity for the ZP. About the second part of the thesis: 1) rabbit doe oviductal transcriptome shows spatial and temporal differences through ovulation and pre-implantational development; 2) Several OF protein concentrations fluctuate along copulation and the end of pre-implantational development, among those: SPP1, NPY and MMP7; 3) Response to ovulation and copulation involves certain molecular mechanisms conserved across different mammalian species, favouring the expression of SERPINE1, SPP1 and PTGS2; 4) Response to embryo presence within the oviduct involves a local regulation of the immune system. However, it has not been discovered a clear universal mechanism of response due to discrepancy of results among species.