Mechanisms of speciation in bryophytes: evolutionary studies in the moss Funaria hygrometrica along environmental gradients

Abstract

El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue contribuir al conocimiento de la importancia de la geografía y el clima en la variación genética y su papel como mecanismos de especiación en briófitos con amplias distribuciones. Se utilizó como modelo de estudio el musgo cosmopolita Funaria hygrometrica. Se realizó un estudio multidisciplinar en el que se combinó el análisis de la ploidía, el estudio de la variabilidad genética mediante diversas metodologías y marcadores genéticos, genética del paisaje, análisis del transcriptoma, datos morfométricos y biogeográficos. Se emplearon muestras procedentes de cuatro áreas geográficas de España con diferentes regímenes climáticos (las provincias de Asturias, León y Murcia, y las montañas de Sierra Nevada), además de otras especies del género Funaria (F. aequidens, F. arctica, F. flavicans y F. polaris) y una muestra de F. hygrometrica de Chile. Mediante citometría de flujo se detectaron cuatro citotipos. Solo uno de ellos fue haploide y estaba presente en el 67,4% de los individuos analizados. El resto de individuos presentaban alguno de los otros tres citotipos, que eran diploides, pero con distinta cantidad de ADN. Un posible mecanismo para explicar las diferencias dentro de los diploides es el número variable de cromosomas accesorios, que se sabe que están presentes en ciertas especies de musgos. Para describir los niveles de diferenciación genética entre las poblaciones de F. hygrometrica en las cuatro áreas estudiadas se realizó el genotipado de todas las muestras recolectadas y cultivadas in vitro, por medio de la técnica genómica Genotyping by sequencing (GBS). También se llevó a cabo la secuenciación Sanger de tres marcadores genéticos (nuclear, mitocondrial y cloroplástico) en algunos individuos de Sierra Nevada. Con estos análisis se confirmó la existencia de dos genotipos claramente diferenciados: uno restringido a las zonas altas de Sierra Nevada (por encima de los 1600 m s.n.m.) y a unos pocos individuos del resto de áreas estudiadas, y otro genotipo generalista, presente en todo el gradiente altitudinal de Sierra Nevada y mayoritaro en el resto del territorio estudiado. Se observó una mayor proximidad filogenética y de expresión génica entre el genotipo de distribución restringida y la muestra de F. hygrometrica de Chile, lo que pone de manifiesto su elevada capacidad de dispersión a larga distancia, mientras que el genotipo generalista estuvo más relacionado con las otras especies estudiadas.No se observaron evidencias de hibridación entre ambos linajes genéticos, ni siquiera en localidades donde cohabitan, lo que sugiere un aislamiento reproductivo. La reproducción sexual por autofecundación en ambos grupos genómicos podría explicar la ausencia de recombinación entre ellos. Estudios de genética del paisaje para conocer la importancia de la geografía (aislamiento por distancia, IBD) versus la ecología (aislamiento por ambiente, IBE) para explicar la diferenciación genética no apoyaron la reciente colonización y expansión en Sierra Nevada. Revelaron además, que la estructura genética no se alinea con la diferenciación ambiental en poblaciones de Asturias, León y Murcia, mientras que a lo largo del gradiente altitudinal de Sierra Nevada la variable climática isotermalidad constituyó el modelo que mejor explicó la estructura genética observada. Ello apunta a que una potencial barrera, aunque no absoluta, podría restringir la dispersión o el establecimiento efectivo, lo que promovería en última instancia el aislamiento ecológico. Mediante la técnica RNAseq se comparó la expresión génica entre muestras sometidas a condiciones de estrés térmico y de control. Los datos transcriptómicos apuntaron a que podría haber diferencias en la tolerancia al estrés térmico entre los dos linajes genéticos, ya que los genes expresados diferencialmente en condiciones de estrés térmico pertenecieron a la categoría de ontología génica “Unión a proteínas desplegadas”, que consta principalmente de proteínas de choque térmico. Se observó una mayor diferencia de expresión génica intraespecífica que interespecífica. El estudio morfométrico de individuos de Sierra Nevada no mostró una diferenciación morfológica significativa entre los grupos de individuos clasificados según su identidad genética, distribución altitudinal y nivel de ploidía. Por el contrario, las especies F. aequidens, F. arctica, F. flavicans y F. polaris se distinguieron morfológicamente de F. hygrometrica a pesar de que los datos genéticos mostraron mayor proximidad a las muestras con genotipo de distribución amplia de Sierra Nevada. Esta falta de variación morfológica en F. hygrometrica apunta a que los dos genotipos podrían ser especies crípticas dentro de una morfoespecie, que parecen tener una evolución o divergencia más rápida a nivel molecular que a nivel morfológico. Una simulación de los patrones de distribución de las dos posibles especies crípticas mostró que podrían compartir el mismo hábitat, incluso si compiten fuertemente por los mismos recursos y una de ellas tiene cierta ventaja selectiva en ese hábitat, siempre y cuando lleguen a este hábitat un número suficiente de migrantes de otras localidades. Este trabajo pone de manifiesto la importancia de considerar múltiples fuentes de evidencia empírica para inferir procesos evolutivos y aplicar criterios taxonómicos en especies de briófitos de amplia distribución.

The general objective of this Doctoral Thesis was to contribute to the knowledge on the importance of geography and climate in shaping genetic variation and their role as speciation mechanisms in bryophytes that exhibit wide distributions. The cosmopolitan moss Funaria hygrometrica was used as a study model. A multidisciplinary study was carried out in which a ploidy analysis, the study of genetic variability using various genetic markers and methodologies, landscape genetics, transcriptome analysis, quantitative morphometrics and biogeographic approaches were combined. Samples from four geographical areas of Spain with different climatic regimes were used (Asturias, Leon and Murcia, and the Sierra Nevada Mountains), in addition to a sample from Chile and other species of the genus Funaria (F. aequidens, F. arctica, F. flavicans, and F. polaris). Four cytotypes were detected by flow cytometry. Only one of them was haploid and was present in 67.4% of the individuals analysed. The rest of the individuals had one of the other three cytotypes, which were diploid, but with different genome sizes. One possible mechanism to explain these differences within diploids is the variable number of accessory chromosomes, which are known to be present in certain moss species. To describe the levels of genetic differentiation among F. hygrometrica populations in the four studied areas, all collected samples were cultivated in vitro and genotyped using the Genotyping by sequencing (GBS) genomic technique. Sanger sequencing of the three genomic compartments (nuclear, mitochondrial, and chloroplastic) was also carried out in some individuals from the Sierra Nevada Mountains. Based on all these analyses, the presence of two clearly differentiated genotypes was confirmed: one restricted to the highlands of the Sierra Nevada Mountains (above 1600 m a.s.l.) and a few individuals from the rest of the studied areas; and another generalist genotype, present in the entire altitudinal gradient of the Sierra Nevada Mountains and preponderant in the rest of the studied territory. A greater phylogenetic and gene expression proximity was observed between the restricted distribution genotype and the sample of F. hygrometrica from Chile, which shows its high long-distance dispersal capacity, while the generalist genotype was more related to the other studied Funaria species. Hybridization between both lineages could not be confirmed in the Sierra Nevada Mountains, not even in localities where they coexist, suggesting reproductive isolation. Sexual reproduction by self-fertilization in both genomic groups might explain the absence of recombination between them. Landscape genetics to understand the importance of geography (isolation by distance, IBD) versus ecology (isolation by environment, IBE) in order to explain genetic differentiation patterns revealed that the genetic structure does not align with an environmental barriers in populations of Asturias, Leon, and Murcia, while along the altitudinal gradient of the Sierra Nevada Mountains, the climatic variable isothermality constituted the model that best explains the observed genetic structure. This suggests that a potential barrier, although not absolute, might restrict dispersal or the effective establishment, ultimately promoting ecological isolation. To compare gene expression between samples subjected to heat stress and control conditions was possible using the RNAseq technique. Transcriptomic data pointed to the direction that there might be differences in heat stress tolerance between the two genetic lineages since the genes differentially expressed under thermal stress conditions belonged to the gene ontology category "Unfolded protein binding", which consists mainly of heat shock proteins. A greater difference in intra-specific than inter-specific gene expression was observed. The biometric study of individuals from Sierra Nevada Mountains did not show significant morphological differentiation between individual groupings classified according to their genetic cluster, altitudinal distribution, and ploidy level. On the contrary, the species F. aequidens, F. arctica, F. flavicans, and F. polaris were morphologically distinguished from F. hygrometrica even though the genetic data showed greater proximity to the individuals with a wide distribution genotype from the Sierra Nevada Mountains. This lack of morphological variation within F. hygrometrica suggests that the two genotypes could be cryptic species within a morphospecies, which seem to have a faster evolution or divergence at the molecular level than at the morphological one. A simulation of the distribution patterns of the two possible cryptic species showed that they could share the same habitat, even if they compete strongly for the same resources and one of them has a certain selective advantage in that habitat. The condition is that a sufficient number of migrants arrive in this habitat from other localities, where the selective advantage is inverted. This work emphasizes the importance of considering multiple sources of empirical evidence to infer evolutionary processes and apply taxonomic criteria in broadly distributed bryophyte species.