Validation of automated assays for the assessment of stress and welfare in saliva

Abstract

Las situaciones de estrés o que producen un bajo grado de bienestar dan lugar a comportamientos y estados fisiológicos inapropiados en los animales, que en las especies ganaderas se traduce en un descenso en la producción. Pero la correcta evaluación del estrés para intentar evitar sus causas y consecuencias es uno de los principales retos en el ámbito del estudio del bienestar animal debido a la imposibilidad de los animales de expresarlo verbalmente. Tradicionalmente el cortisol se ha usado para evaluar los cambios psicológicos que ocurren por estrés. Sin embargo, hay otros mecanismos fisiológicos envueltos en la reacción de estrés que también pueden directa o indirectamente interactuar e inducir cambios, por ejemplo, en el sistema inmune o en el estado oxidativo. Sin embargo, hay muy pocos estudios que hayan evaluado marcadores de estrés diferentes al cortisol en saliva en las diferentes especies veterinarias. Además, no hay trabajos en los que se aplique un perfil analítico en saliva que, desde un punto de vista integrador, pudiera evaluar el estrés mediante sus diferentes vías de activación e interacción. Por tanto, los objetivos de la actual Tesis doctoral fueron: 1) avanzar en el estudio de la alfa-amilasa salival (sAA, por sus siglas en inglés, salivary alpha-amylase), una enzima evaluadora del sistema nervioso simpático, en las diferentes especies domésticas y en humana como modelo experimental de comparación; 2) mejorar el conocimiento sobre otros posibles biomarcadores de estrés y bienestar que puedan determinarse en saliva mediante técnicas de medición automatizadas; y 3) evaluar los posibles factores que pudieran afectar a la interpretación de los resultados de los biomarcadores salivales evaluados. Además, mediante la publicación de un capítulo de libro, se profundizó en el conocimiento de la anatomía y fisiología de las glándulas salivales para un apropiado conocimiento sobre cómo se forma la saliva y cómo ésta contiene los analitos que pueden ser medidos para la evaluación de estrés. Para el primer objetivo, se realizaron estudios en los que se evaluó cuál sería la mejor forma de expresar los resultados de la sAA, se investigaron los posibles cambios de sus proteoformas en diferentes situaciones estresantes, y se validaron ensayos en las especies canina, equina y porcina. Para el segundo, se validaron ensayos automatizados en saliva de la especie equina, porcina, ovina y bovina para la medición de biomarcadores de estrés y bienestar diferentes a la sAA, y se estudiaron cómo estos biomarcadores se comportan en diferentes situaciones relacionadas con estresores psicológicos, físicos e inflamatorios. Y para el tercer objetivo, se midieron esos biomarcadores de estrés en saliva de la especie equina limpias y contaminadas con alimento u obtenidas con esponja o algodón, además de valorarse posibles variaciones debido al ritmo circadiano, con el fin de evaluar posibles diferencias en sus resultados debido a estos factores. En conclusión, se observó que la actividad sAA es más sensible que la medida de su concentración para detectar cambios inducidos por estrés o dolor en las especies humana, equina y porcina; la sAA existe en la saliva de la especie canina, y su actividad puede incrementar tras una estimulación simpática; la enzima sAA tiene diferentes proteoformas que muestran diferentes cambios según el modelo de estrés aplicado; lipasa, TEA, BChE, ADA, TP, gGT, CK, urea, bilirrubina total, fósforo y lactato pueden medirse en saliva a través de ensayos automatizados de una forma rápida y fiable, y podrían considerarse biomarcadores de estrés; y el grado de contaminación de la saliva con comida, el método de recolección de la misma y el ritmo circadiano pueden modificar los valores de algunos de los analitos evaluados en la presente Tesis.

The stress and low welfare conditions produce inappropriate behaviors and anxiety in animals leading to a decrease in animal production efficiency in livestock. The leading causes of stress can be psychological, physical such as intense exercise or pain, and inflammation or disease. The accurate assessment of stress to detect it and avoid its causes and consequences is one of the main challenges in animal welfare research since verbal self-report is not possible. Traditionally, cortisol has been used to evaluate physiological changes in stress. However, other pathways involved in the stress reaction can also directly or indirectly interact on different systems and induce changes to immunity level or in the oxidative status. However, evaluating biomarkers of stress other than cortisol in saliva in veterinary species is still in its infancy. Besides, there is a lack of studies in which different analytes are applied in an integrated way, using profiles to evaluate the stress by its different pathways and interactions. Therefore, the objectives of this Ph.D. Thesis were: 1) to advance in the study of the salivary alpha-amylase (sAA) in different veterinary species and humans as an experimental model for comparing, 2) to increase the knowledge in other possible biomarkers of stress and welfare that can be measured in saliva by automated assays, and 3) to evaluate possible factors that would affect the interpretation of results in the biomarkers of saliva. Additionally, the knowledge of the anatomy and physiology of the salivary glands was described by the publication of a book chapter to increase the knowledge of how saliva is formed and how it contains analytes that can be measured for stress evaluation. For the first objective, several studies were performed to assess the optimal way to report the sAA results, investigate the possible proteoforms’ changes at different stress situations, and validate assays in different species such as dogs, horses, and pigs. For the second objective, automated assays were validated in saliva from horse, pig, sheep, and cow to measure stress and welfare biomarkers different from sAA and study how these biomarkers behave in different situations related to psychological, physical, and inflammatory stressors. Finally, for the third objective, those salivary biomarkers were measured in clean and with food contamination equine saliva or obtained with sponge or cotton roll, and assessed for possible changes in their circadian rhythm to evaluate if their results could be affected by these factors. In conclusion, the activity of sAA is more sensitive than the quantification of its concentration to detect changes in this enzyme induced by stress or pain in humans, horses, and pigs; sAA exists in the dog’s saliva, and its activity can increase when an experimental stimulation of the sympathetic nervous system is carried out; the sAA has different proteoforms that show different changes depending on the stress models; a panel of salivary biomarkers including Lip, TEA, BChE, ADA, TP, gGT, CK, urea, total bilirubin, phosphorus, and LA can be measured by automated assays in a fast and reliable way and can be associated with stress; and the degree of food contamination in saliva, the collection method, and circadian rhythm can modify the values of some of the analytes assessed in the present Thesis.