Microbial biodiversity assessment of artificial microhabitats : examples from Egyptian archaeological sites

Abstract

El objetivo general de esta tesis doctoral fue conocer la diversidad microbiana presente en microhábitats de yacimientos arqueológicos de elevado valor cultural, expuestos constantemente a condiciones ambientales duras y áridas. Se eligieron las pirámides de Djoser y Lahun para llevarlo a cabo, dos de las más antiguas y grandes de la necrópolis de Memphis del antiguo Egipto. El estudio se centró en las bacterias y hongos que habitan las piedras y rocas de estos yacimientos arqueológicos, denominados por sus siglas en inglés, SIB (stone-inhabiting bacteria) y RIF (rock-inhabiting fungi). Se realizaron estudios comparativos microbianos mediante análisis de metabarcoding basado en amplicones, métodos de aislamiento tradicionales de cultivo in vitro y técnicas de microscopía de epifluorescencia. El análisis de metagenómica de ambas pirámides permitió identificar 644 especies de bacterias y 204 de hongos. En los ensayos de aislamiento se identificaron 28 especies bacterianas y 34 de hongos. Un total de 19 especies de bacterias y 16 de hongos dependían exclusivamente del cultivo, mientras que 92 especies de bacterias y 122 de hongos eran independientes del cultivo. Las bacterias más abundantes fueron de los géneros Bacillus, Blastococcus y Planococcus. Los hongos más abundantes fueron Knufia karalitana y Pseudotaeniolina globosa. Se realizó la caracterización morfológica, fisiológica y molecular de la cepa del hongo meristemático negro P. globosa, aislada en la pirámide de Djoser y se comparó con una cepa italiana. Todos los datos confirmaron la coespecificidad de las dos cepas. Sin embargo, la egipcia fue capaz de crecer en rangos más amplios de temperatura y pH que la italiana, así como a niveles extremos de salinidad y mostró mucha más tolerancia al calor y a las radiaciones UV. Sobre la base de los resultados filogenéticos usando cinco marcadores (ITS, nrSSU/18S, nrLSU/28S, BT2 y RPB2), P. globosa se atribuyó a la familia Teratosphaeriaceae (Capnodiales). La cepa egipcia se puede considerar una biovariante bien adaptada a entornos extremos y duros. Asimismo, se diseñaron dos marcadores moleculares específicos para detectar rápidamente y a bajo coste la presencia de Actinobacteria que viven sobre piedras (SIAb) antes de realizar análisis adicionales. La búsqueda de marcadores se centró en la vía de la síntesis de aminoácidos similares a las micosporinas (MAAs). Mediante “minería genómica” se obtuvieron dos genes candidatos: un homólogo de un gen clave en los MAAs y las vías del siquimato conocido como DAHP II (aroF) y otro homólogo del gen Corismato mutasa (cm2). Ambos se encontraron principalmente en Actinobacteria. Después de la calibración los cebadores de nuevo diseño se aplicaron con éxito al ADN ambiental extraído de las pirámides de Djoser y Lahun utilizando PCR cuantitativa. Se concluyó que la diversidad microbiana en ambas pirámides fue mayor de lo esperado, considerando las duras condiciones de los sitios de muestreo. Se confirmó que el mejor enfoque metodológico para estudiar una comunidad microbiana compleja es a través de la combinación de microscopía e identificación molecular para microbios dependientes del cultivo y de métodos de metagenómica para aquellos independientes del cultivo. El potencial efecto biodeteriorante de algunos de los SIB y RIF hallados sobre tan importante patrimonio cultural requiere atención para diseñar planes y buscar soluciones de conservación para limitar su presencia. El desarrollo de nuevos métodos de identificación de SIAb permite un mayor conocimiento de la diversidad de organismos presentes en los monumentos al aire libre ya que puede llevar al descubrimiento de nuevas especies o biovariantes. El conocimiento de los mecanismos precisos de los microorganismos para habitar los monumentos y su papel en el biodeterioro está poco estudiado, lo que exige más investigación en el futuro, tanto a nivel genómico, como transcriptómico y metabólico utilizando enfoques basados en secuenciación de nueva generación y bioinformática.

The general objective of this doctoral thesis was to know the microbial diversity present in microhabitats of archaeological sites with high cultural value, constantly exposed to harsh and arid environmental conditions. The pyramids of Djoser and Lahun were chosen to carry it out, two of the oldest and largest in the Memphis necropolis of ancient Egypt. The study focused on the bacteria and fungi that inhabit the stones and rocks of these archaeological sites, known for their acronyms in English, SIB (stone-inhabiting bacteria) and RIF (rock-inhabiting fungi). Microbial comparative studies were carried out using amplicon-based metabarcoding analysis, traditional in vitro culture isolation methods and techniques of epifluorescence microscopy. The metagenomic analysis of both pyramids allowed the identification of 644 species of bacteria and 204 of fungi. In isolation tests, 28 bacterial and 34 fungal species were identified. A total of 19 species of bacteria and 16 of fungi were exclusively culture-dependent, while 92 species of bacteria and 122 of fungi were culture-independent. The most abundant bacteria were of the Bacillus, Blastococcus and Planococcus genera. The most abundant fungi were Knufia karalitana and Pseudotaeniolina globosa. The morphological, physiological and molecular characterization of the strain of the black meristematic fungus P. globosa, isolated in the Djoser pyramid, was carried out and compared with an Italian strain. All data confirmed the conspecificity of the two isolates. However, the Egyptian one was able to grow under broader ranges of temperature and pH than the Italian, as well as extreme levels of salinity, and showed much more tolerance to heat and UV radiation. Based on the phylogenetic results using five markers (ITS, nrSSU/18S, nrLSU/28S, BT2 and RPB2), P. globosa was attributed to the family Teratosphaeriaceae (Capnodiales). The Egyptian strain can be considered a biovar well-adapted to extreme and harsh environments. In addition, two specific molecular markers were designed to detect inhabiting Actinobacteria (SIAb) the presence of stone quickly and inexpensively prior to further testing. The search for markers focused on the pathway for the synthesis of mycosporine-like amino acids (MAAs). Through “genomic mining”, two candidate genes were obtained: a homologue of a key gene in the MAAs and the shikimate pathways known as DAHP II (aroF) and another homologue of the Chorismate mutase gene (cm2). Both were found mainly in Actinobacteria. After calibration, the newly designed primers were successfully applied to environmental DNA extracted from the pyramids of Djoser and Lahun using quantitative PCR technique. It was concluded that the microbial diversity in both pyramids was higher than expected, considering the harsh conditions of the sampling sites. It was confirmed that the best methodological approach to study a complex microbial community is through the combination of microscopy and molecular identification for culture-dependent microbes and metagenomic methods for culture-independent ones. The potential bio-deteriorating effect of some of the SIBs and RIFs found on such an important cultural heritage sites requires attention to design conservation plans and find solutions to limit their presence. The development of new identification methods for SIAb allows a greater understanding of the diversity of organisms present in outdoor monuments, as it can lead to the discovery of new species or biovariants. The knowledge of the precise mechanisms of microorganisms to inhabit monuments and their role in biodeterioration is little studied, which requires more research in the future, both at the genomic, transcriptomic and metabolic levels using approaches based on next generation sequencing and bioinformatics.