Biomarcadores celulares, moleculares y genéticos de linfocitos B para el rechazo y tolerancia del aloinjerto renal

Abstract

OBJETIVOS: El objetivo general de la tesis es evaluar si los procesos que median el rechazo y tolerancia al aloinjerto renal están reguladores por diferentes biomarcadores genéticos, moleculares y celulares de linfocitos B. Para ello, se abordaran los siguientes objetivos específicos: 1) Monitorizar subpoblaciones de linfocitos B y evaluar su utilidad pronóstico para el post-trasplante. 2) Estudiar polimorfismos funcionales y cuantificar los niveles de moléculas del sistema BAFF para, posteriormente, correlacionar con la evolución del trasplante y la producción de anticuerpos anti-HLA específicos frente al donante. 3) Estudiar miARN implicados en el desarrollo y activación de linfocitos y establecer su relación con el rechazo agudo del injerto. 4) Búsqueda de biomarcadores y desarrollo de modelos diagnósticos de rechazo mediado por anticuerpos mediante técnicas bioinformáticas. METODOLOGÍA: En la presente tesis se incluyeron muestras de pacientes sometidos a trasplante renal realizados entre el año 2013 y el 2018 en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de Murcia. La monitorización de subpoblaciones de linfocitos B se realizó mediante citometría de flujo. Los polimorfismos y la expresión génica de moléculas del sistema BAFF y de miARN se estudiaron mediante PCR cuantitativa, y las formas solubles mediante ELISA. Por último, se realizó un meta-análisis con estudios de la base de datos GEO y se emplearon diferentes aplicaciones bioinformáticas (xCell, Gene2Drug etc.) para el análisis de los datos. CONCLUSIONES: 1) Los perfiles inmunológicos basados en subpoblaciones de linfocitos B (LB) permiten agrupar a los trasplantados renales según el diferente riesgo de rechazo agudo. Los trasplantados que presentan niveles disminuidos de LB transicionales y plasmablastos se asocian a una peor función renal y mayor incidencia de rechazo agudo durante el primer año post-trasplante. Además, la elevación de LB transicionales durante el post-trasplante se asocia con un aumento de los linfocitos T reguladores en el mismo periodo, por tanto, la elevación de subpoblaciones de carácter inmunosupresor parece ejercer un efecto protector frente al rechazo del injerto. 2) El estudio de biomarcadores del sistema BAFF, muestra que el polimorfismo rs3803800 del gen TNFSF13, que codifica para APRIL, modifica el riesgo de sufrir rechazo agudo. Los análisis bioinformáticos sugieren que este polimorfismo podría alterar la regulación del splicing y de esta manera repercutir en los niveles de expresión de APRIL. Además, los niveles séricos de APRIL aumentan durante el rechazo agudo, por lo tanto, su cuantificación podría ser empleada para el diagnóstico no invasivo de rechazo. Por otra parte, la elevación de la expresión génica de los receptores R-BAFF y TACI se asocia con un mayor riesgo de desarrollo de anticuerpos anti-HLA donante específicos. 3) Los niveles de expresión de miR-150-5p están disminuidos en trasplantados renales con rechazo agudo. Los análisis bioinformáticos de los genes diana de miR-150-5p sugieren que la sobre-expresión de MBD6 y de genes de la vía de señalización del receptor EGF, podrían estar involucrados en la desregulación de la expresión de genes implicados en el rechazo agudo. 4) Los análisis bioinformáticos muestran la importancia de la vía de señalización IRF/STAT1 de respuesta a interferones durante el rechazo mediado por anticuerpos (RMA). A nivel celular, la infiltración de linfocitos NK y monocitos en el aloinjerto, así como el aumento de la maduración de células dendríticas, ejercen un papel central en la mediación del daño que sufre el injerto durante el RMA. Los modelos basados en algoritmos TSP muestran una alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico no invasivo del RMA, que junto con el bajo coste y facilidad de interpretación, hace de los modelos TSP idóneos para su utilización en laboratorios clínicos de rutina.

OBJECTIVES: The general objective of the thesis is to evaluate whether the processes that mediate rejection and tolerance to the renal allograft are regulated by different genetic, molecular and cellular biomarkers of B lymphocytes. For this, the following specific objectives will be addressed: 1) Monitor subpopulations of B lymphocytes and evaluate their prognostic usefulness for post-transplantation. 2) To study functional polymorphisms and quantify the levels of molecules of the BAFF system to later correlate with the evolution of the transplant and the production of specific anti-HLA antibodies against the donor. 3) Study miRNAs involved in the development and activation of lymphocytes and establish their relationship with acute graft rejection. 4) Search for biomarkers and development of diagnostic models for antibody-mediated rejection using bioinformatic techniques. METHODOLOGY: This thesis includes samples of patients undergoing kidney transplantation performed between 2013 and 2018 at the Virgen de la Arrixaca University Clinical Hospital in Murcia. Monitoring of B lymphocyte subpopulations was performed by flow cytometry. Polymorphisms and gene expression of BAFF system molecules and miRNA were studied by quantitative PCR, and soluble forms by ELISA. Finally, a meta-analysis was performed with studies from the GEO database and different bioinformatics applications (xCell, Gene2Drug etc.) were used for data analysis. CONCLUSIONS: 1) Immunological profiles based on B lymphocyte (LB) subpopulations make it possible to group kidney transplant patients according to the different risk of acute rejection. Transplant patients with decreased levels of transitional LB and plasmablasts are associated with worse kidney function and a higher incidence of acute rejection during the first year after transplantation. In addition, the elevation of transitional LB during post-transplantation is associated with an increase in regulatory T lymphocytes in the same period, therefore, the elevation of subpopulations of an immunosuppressive nature seems to exert a protective effect against graft rejection. 2) The study of biomarkers of the BAFF system shows that the polymorphism rs3803800 of the TNFSF13 gene, which codes for APRIL, modifies the risk of suffering acute rejection. Bioinformatic analyzes suggest that this polymorphism could alter the regulation of splicing and thus affect the expression levels of APRIL. Furthermore, serum APRIL levels increase during acute rejection, therefore, its quantification could be used for the non-invasive diagnosis of rejection. On the other hand, the elevation of the gene expression of R-BAFF and TACI receptors is associated with an increased risk of development of donor-specific anti-HLA antibodies. 3) The expression levels of miR-150-5p are decreased in kidney transplant patients with acute rejection. Bioinformatic analyzes of the target genes of miR-150-5p suggest that the overexpression of MBD6 and of genes of the EGF receptor signaling pathway could be involved in the dysregulation of the expression of genes involved in acute rejection. 4) Bioinformatic analyzes show the importance of the IRF / STAT1 signaling pathway in response to interferons during antibody-mediated rejection (AMR). At the cellular level, the infiltration of NK lymphocytes and monocytes into the allograft, as well as the increased maturation of dendritic cells, play a central role in mediating the damage suffered by the graft during AMR. Models based on TSP algorithms show high sensitivity and specificity for the non-invasive diagnosis of AMR, which, together with their low cost and ease of interpretation, makes the TSP models ideal for use in routine clinical laboratories.