Catálisis y regulación de tirosinasa ante fenonas, arbutinas y ácidos hidroxicinámicos

Abstract

OBJETIVOS: En esta tesis se han marcado como objetivos profundizar en el conocimiento del mecanismo de acción de tirosinasa, así como desarrollar un método que sea fiable para distinguir los verdaderos sustratos alternativos, activadores e inhibidores de la enzima.

METODOLOGÍA: Se realizaron las siguientes técnicas: aislamiento, concentración y purificación de tirosinasa, sirviéndonos de FPLC o microgeles de electroforesis, para disponer de una isoenzima purificada; caracterización de la actividad, y regulación por inhibición e inactivación enzimática de tirosinasa, utilizando sustratos cromogénicos y fluorogénicos y ensayos de absorbancia mediante espectrofotometría ultravioleta/visible; optimización de métodos cromatográficos con detección mediante espectrometría de masas (GC-MS y HPLC-MS), para la identificación y cuantificación de biomoléculas; ensayos de RMN, para obtener valores de desplazamiento químico y acoplamiento molecular computacional o docking, para entender los modos de unión de tirosinasa con distintos ligandos; y, finalmente, cuantificación de la fiabilidad de los resultados experimentales obtenidos mediante parámetros de estadística descriptiva y pruebas de significación estadística.

CONCLUSIONES: Gracias al desarrollo de esta tesis, se ha avanzado en el estudio del mecanismo cinético y estructural de la enzima tirosinasa, y se han establecido criterios cinéticos para distinguir entre sustratos alternativos, activadores e inhibidores, siendo además los mecanismos propuestos, apoyados y confirmados por los estudios de docking. De este modo, se confirmó que las 3-4/-aminoacetofenonas son realmente inhibidores, a pesar de exhibir activación o inhibición en función de la cantidad de L-dopa utilizada en los ensayos; un hecho que se justifica por la formación de un aducto de mayor absorbancia que el dopacromo. Se confirmó el compuesto 2,2',4,4'-tetrahidroxibenzofenona (Uvinul D50) como inhibidor de la enzima, estableciendo como nuevas constantes de inhibición aparente e IC50 los valores de 2.02 ± 0.09 mM y 3.82 ± 0.39 mM, respectivamente. También se estudió la acción de tirosinasa sobre los ácidos cafeico y p-cumárico, mediante nuevos métodos que evitaran interferencias por la inestabilidad de los compuestos generados, y que así, permitieran su correcta caracterización cinética. Posteriormente se estudiaron los agentes despigmentantes, α y β-arbutina, y su derivado la desoxiarbutina en sendos artículos, comprobando que ambos casos se tratan realmente de sustratos alternativos de la enzima, hecho que debe ser tenido en cuenta para su aplicación en cremas cosméticas. Además, se demostró que la desoxiarbutina es el único sustrato de tirosinasa descubierto hasta el momento que no libera o-difenol al medio después de la hidroxilación. El siguiente estudio fue realizado acerca de la acción de tirosinasa sobre ácido cafeico y su n-nonil éster, el n-nonil cafeato, que resultaron ser sustratos suicidas que inactivan la enzima, siendo el cafeato más potente que el cafeico en este aspecto. Finalmente, se estudió la acción de tirosinasa sobre ácido cinámico y algunos de sus derivados, comprobando que los ácidos cinámico, 2-hidroxicinámico, 2,3 y 4-metoxicinámico son inhibidores de tirosinasa, mientras que los ácidos 3-hidroxicinámico, 4-hidroxicinámico y 3,4-dihidroxicinámico actúan como sustratos de tirosinasa. Además, se caracterizó cada uno de ellos con sus correspondientes constantes cinéticas.

OBJECTIVES: For this thesis, they had been established as objectives to deepen in the mechanism of the action of tyrosinase and to develop a reliable method to distinguish the true alternative substrates, activators and inhibitors of the enzyme.

METHODOLOGY: The following techniques were made: isolation, concentration and purification of tyrosinase, using FPLC or microgel electrophoresis, to obtain a purified isoenzyme; characterization of the activity of tyrosinase, and regulation of the enzyme by means of inhibition or activation, using cromogenic and fluorogenic substrates as well as absorbance essays with Ultraviolet/visible spectrophotometry; optimization of chromatographic methods with detection by using mass spectrometry (GC-MS and HPLC-MS), to identify and quantify biomolecules; NMR essays, to obtain chemical shift values and computational simulation of molecular coupling or docking, to understand the types of binding of tyrosinase with different ligands; and finally, quantification of the reliability of the experimental results obtained by means of parameters of descriptive statistics and tests of statistical significance.

CONCLUSIONS: Thanks to the development of this thesis, the understanding of the kinetic and structural mechanism of tyrosinase has advanced, and kinetic criteria to distinguish between alternative substrates, activators and inhibitors of the enzyme has been established. Moreover, these findings have been supported and confirmed by docking studies. In this way, we confirmed that 3-4/-aminoacetophenones are really inhibitors, despite showing activation or inhibition depending on the quantity of L-dopa used in the essays, which is due to the formation of an adduct which absorbs more than dopachrome. 2,2',4,4'-tetrahydroxybenzophenone (Uvinul D50) was confirmed as an inhibitor of the enzyme, establishing the new constants of apparent inhibition and IC50 as 2.02 ± 0.09 mM y 3.82 ± 0.39 mM, respectively. We also studied the action of tyrosinase on caffeic and p-coumaric acids, by using new methods to avoid interferences caused by the instability of the generated compounds, so the kinetic characterization was correct. Subsequently, the depigmenting agents α y β-arbutin were studied as well as their derived desoxiarbutin, checking that are alternative substrates of the enzyme, so it has to be taken into account for its use in cosmetics. Moreover, desoxiarbutin was proved as the single discovered substrate that not release o-diphenol to the medium after the hydroxylation. The following research was about the action of tyrosinase on caffeic acid and its n-nonyl ester, n-nonyl caffeate, which were proved as suicide substrates that inactivate the enzyme. N-nonyl caffeate showed more potency to inactivate the enzyme than caffeic acid. Finally, the action of tyrosinase on cinnamic acid and some derivatives was studied, checking that cinnamic, 2-hydroxycinnamic, 2,3 and 4-methocycinnamic acids are inhibitors of tyrosinase, whereas 3-hydroxycinnamic, 4-hydroxycinnamic and 3,4-dihydroxycinnamic acids are substrates of the enzyme. Moreover, the kinetic constants of these compounds were characterized.