Estudio funcional de los espermatozoides que responden a los quimioatrayentes fluido folicular, fluido oviductal, medio condicionado y progesterona en la especie porcina

Abstract

En mamíferos, el encuentro espermatozoide–ovocito no es un evento que ocurra al azar, sino que los espermatozoides deben ser guiados hasta el gameto femenino (Eisenbach & Giojalas, 2006). La quimiotaxis, el movimiento del espermatozoide hacia el ovocito guiado por un gradiente de concentración de atrayentes químicos, es una técnica que se viene utilizando cada vez más en estudios de espermatozoides in vitro. El uso de biofluidos procedentes de la hembra como quimioatrayentes, es una buena alternativa para seleccionar y estudiar espermatozoides aptos para la fecundación. Las hipótesis que nos planteamos en este trabajo fueron que los biofluidos reproductivos [fluido folicular (FF), fluido oviductal (FO), medio condicionado (MC) y progesterona (P4)] en la especie porcina tienen efectos quimiotácticos y son dependientes de la concentración. Además, la selección de espermatozoides por parte de los biofluidos modifica las características bioquímicas y funcionales de los espermatozoides, por lo que mejoran la calidad embrionaria tras la fecundación in vitro (FIV). Los principales objetivos de esta tesis fueron i) Determinar la capacidad quimiotáctica y concentración optima de los biofluidos (FF, FO, MC) sobre espermatozoides porcinos. ii) Realizar un estudio comparativo de las características funcionales y bioquímicas de los espermatozoides que responden o no a factores quimiotácticos. iii) Analizar componentes en los biofluidos responsables de la actividad quimiotáctica y iv) Determinar si existe relación entre la calidad embrionaria y los espermatozoides que respondieron al quimioatrayente FF. En la primera experiencia se determinó la concentración optima de los biofluidos reproductivos (FF, FO, MC) que mayor número de espermatozoides seleccionaban después 20 min de quimiotaxis estableciendo una curva de dilución en forma de campana. Las concentraciones empleadas (v/v) para establecer la curva de dilución con los diferentes biofluidos fueron: FF: 0,13%, 0,25%, 0,5%, 1% y 1,5%; FO: 0,13%, 0,25%, 0,5%, 1% y 1,5%; y MC: 0,033%, 0,065%, 0,13%, 0,25% y 0,5%. Las concentraciones de P4 empleadas como quimioatrayente control, fueron: 1, 2,5, 5, 7,5 y 10 pM. Además, se incluyó un grupo (Σ) compuesto por la suma de los tres biofluidos (FF + FO + MC) para comprobar si había o no algún efecto sinérgico entre estos compuestos. Se estudió el efecto del inhibidor NNC 55-0396, el cual bloquea los canales CatSper y reprime la entrada de calcio (Ca2+) en el espermatozoide. Además, se estudió la composición de los biofluidos reproductivos mediante la técnica de HPLC-MS/MS para determinar la presencia de algunas sustancias relacionadas con la quimiotaxis. En la segunda experiencia realizamos un estudio comparativo de la calidad seminal. Para ello, analizamos la integridad acrosomal, motilidad, test hipoosmótico, fosforilación en tirosina, FIV y fragmentación de ADN. En la tercera experiencia nos planteamos analizar la posible relación entre la selección espermática con el FF y la calidad embrionaria, analizando la producción de embriones desde la división embrionaria a las 48h hasta el estadio de blastocisto expandido a las 168h. Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral muestran que los biofluidos reproductivos (FF, FO y MC) en la especie porcina, tienen efectos quimiotácticos y son dependientes de la concentración, presentan mejores características funcionales cuando se someten a una condición hipoosmótica. Además, únicamente los espermatozoides seleccionados con el FF incrementan la tasa de penetración y mejora la velocidad de desarrollo del embrión así como la calidad embrionaria.

In mammals, the sperm-oocyte encounter is not a random event, but the sperm must be guided to the female gamete (Eisenbach & Giojalas, 2006). In this sense, three mechanisms responsible for guiding sperm have been described: rheotaxis (movement of the sperm against the flow towards the oocyte), thermotaxis (movement of the sperm towards the oocyte guided by a temperature gradient), and chemotaxis (movement of the sperm towards the oocyte guided by a concentration gradient of chemical attractants). Chemotaxis has been increasingly used for in vitro sperm studies. The use of biofluids from the female as chemoattractants is a good alternative to select and study sperm suitable for fertilization. The hypotheses in this work were that reproductive biofluids [follicular fluid (FF), oviductal fluid (OF), conditioned medium (CM) and progesterone (P4)] in the porcine species have chemotactic effects and are dependent on the concentration. Furthermore, the selection of spermatozoa by biofluids modifies the biochemical and functional characteristics of spermatozoa, thereby improving embryo quality after in vitro fertilization (IVF). The main objectives of this thesis were: i) to determine the chemotactic capacity and optimal concentration of biofluids (FF, OF, CM) on porcine spermatozoa; ii) carry out a comparative study of the functional and biochemical characteristics of sperm that respond or not to chemotactic factors; iii) analyze components in the biofluids responsible for chemotactic activity, and iv) determine if there is a relationship between embryo quality and sperm that responded to the FF chemoattractant. In the first experiment, the optimal concentration of reproductive biofluids (FF, OF, CM) that selected the highest number of sperm cells after 20 min of chemotaxis was determined, establishing a bell-shaped dilution curve. The concentrations used (v / v) to establish the dilution curve with the different biofluids were: FF: 0.13%, 0.25%, 0.5%, 1% and 1.5%; OF: 0.13%, 0.25%, 0.5%, 1% and 1.5%; and CM: 0.033%, 0.065%, 0.13%, 0.25% and 0.5%. The P4 concentrations used as control chemoattractant were: 1, 2.5, 5, 7.5 and 10 pM. Furthermore, a group (Σ) made up of the sum of the three biofluids (FF + OF + CM) was included to check if there was any synergic effect between these compounds. The effect of the inhibitor NNC 55-0396 was studied, which blocks CatSper channels and represses the entry of calcium (Ca2 +) into sperm. In addition, the composition of reproductive biofluids was studied using the HPLC-MS / MS technique to determine the presence of some substances related to chemotaxis. In the second experiment, we carried out a comparative study of semen quality. To do this, we analyzed acrosome integrity, motility, hypoosmotic test, tyrosine phosphorylation, IVF and DNA fragmentation. In the third experience we analyzed the possible relationship between sperm selection with FF and embryo quality, analyzing embryo production from embryo division at 48h to the expanded blastocyst stage at 168h. In this thesis, we reached the following conclusions: i) The greatest chemotactic response of the sperm occurred with low concentrations of the chemoattractants, being 0.25% for FF and OF and 0.13% for the case of CM. ii) The sum of all biofluids (Σ) did not increase the chemotactic effect of the fluids used individually. iii) The spermatozoa selected by the chemoattractants showed better functional and biochemical characteristics when they were subjected to a hypoosmotic condition. iv) Only sperm selection with the use of FF as a chemoattractant increased the percentage of oocytes penetrated during in vitro fertilization, and v) Sperm selection using the FF chemoattractant improved embryo quality and the speed of embryo development.