Resistencia a daptomicina en el género Staphylococcus : Análisis lipídico y genético

Abstract

Daptomicina es un antibiótico lipopeptídico activo frente a bacterias Gram-positivas y utilizado, principalmente, en el tratamiento de infecciones complicadas producidas por Staphylococcus aureus y Enterococcus faecium multirresistentes. Su mecanismo de acción, dependiente de iones Ca2+, no es del todo conocido, aunque está clara la interacción del antibiótico con fosfatidilglicerol, lípido mayoritario de membrana en estos microorganismos. La resistencia a daptomicina es un hecho poco frecuente y se ha asociado al tratamiento con este antibiótico de infecciones causadas por S. aureus. Los mecanismos moleculares de resistencia se han relacionado con genes implicados en la síntesis de diversos componentes de la envoltura celular y en aquellos relacionados con la homeostasis de la misma, como mprF (formación de lisilfosfatidilglicerol), cls2 (síntesis de cardiolipina), yycFG (síntesis de peptidoglicano), vraSR (regulación de la síntesis de la pared), graSR (regulador de la carga neta de la envoltura celular), etc. En el presente trabajo se ha estudiado la influencia de la composición lipídica en la resistencia a daptomicina y en los mecanismos moleculares relacionados con la misma, en aislados clínicos seriados de S. aureus y S. capitis, obtenidos en un mismo paciente que durante el curso de un proceso infeccioso modificaron su sensibilidad al antibiótico a lo largo del tratamiento. S. capitis, considerado tradicionalmente como contaminante, ha surgido en los últimos años como un patógeno nosocomial importante, sobre todo en UCIs neonatales. La composición lipídica se estudió mediante espectrometría de masas con ionización mediante “electrospray” y análisis por tiempo de vuelo (ESI-TOF) y se secuenciaron los cromosomas de parejas de cepas sensible/resistente de ambas especies para estimar los cambios genéticos (mutaciones) entre ellas, que fueron confirmados por PCR y secuenciación de Sanger. En las parejas sensible/resistente se estudió la composición lipídica en presencia y ausencia de daptomicina y se analizó el grosor de pared mediante microscopía electrónica de transmisión. En S. aureus se demostró que la cepa resistente difería en su perfil lipídico del resto de aislados estudiados por su mayor contenido en lisilfosfatidilglicerol (LPG), un fosfolípido catiónico. Esta característica se acompañó de la mutación P314L en la proteína MprF, implicada en la síntesis del fosfolípido. También se observaron mutaciones en el gen purR, regulador del metabolismo de purinas y la adhesina Emb, así como una deleción en una proteína hipotética. La pareja de cepas sensible/resistente de S. aureus no adaptó su composición lipídica a la presencia de antibiótico y tampoco se encontraron variaciones en el grosor de la envoltura celular, por lo que se consideró que la resistencia a daptomicina en el aislado resistente estudiado podría relacionarse con la mutación P314L. Las cepas resistentes de S. capitis mostraron importantes variaciones lipídicas en relación con la cepa sensible de esta especie, destacando en aquellas su bajo contenido en LPG y un gran incremento de diacilglicerol (DAG) y ácidos grasos libres (AGL). El análisis cromosómico de la pareja sensible/resistente evidenció hasta ocho mutaciones en la cepa resistente, destacando las relacionadas con rnJ2, ribonucleasa del complejo degradosoma, y qacB, gen relacionado con el transporte de iones amonio, pero ninguna de ellas implicadas de manera directa en la síntesis de lípidos ni en la regulación de la homeostasis de la envoltura celular. Además, se observó que la cepa resistente mostró un notable incremento del grosor de la envoltura celular. Se comprobó que S. capitis no adapta su composición lipídica a la presencia de daptomicina en el medio de cultivo y que la cepa tiene, como promedio, dos carbonos más en los grupos acilo de sus lípidos de membrana, cuando se compara con la cepa sensible. En S. capitis, la resistencia a daptomicina tiene un reflejo importante en los lípidos de membrana y en el grosor de la pared, sin que cambien los genes implicados en la síntesis y homeostasis de la envoltura celular, algo que puede considerarse inédito en el ámbito de la resistencia a este antibiótico.

Daptomycin is a lipopeptide antibiotic with specific activity against Gram-positive organism and used in treatment of complicated infections caused by Gram-positive bacteria, particularly multirresistant Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium. Its mechanism of action, depending on calcium ions, is not fully understood, but it is clear its interaction with phosphatidylglycerol, majority lipid in these bacterial membranes. Daptomycin resistance is a rare event, associated with treatments of S. aureus infections. The molecular mechanism of this resistance has been related with genes involved with the synthesis and homeostasis of the cell envelope, such us mprF (synthesis of lisylphosphatidylglycerol), cls2 (synthesis of cardiolipin), yycFG (synthesis of peptidoglycan), vraSR (regulator of the cell wall synthesis), graSR (regulator of the cell envelope charge), etc. In this work we have studied the influence of the lipid composition in the daptomycin resistance and in the molecular mechanisms related with this resistance in serial clinical isolates of S. aureus and S. capitis, got each one of the same patient, that changed their antibiotic susceptibility during the infection. S. capitis, considered as a contaminating microorganism, has emerged in recent years as an important nosocomial pathogen, especially in neonatal ICUs. The lipid composition was studied by mass spectrometry with electrospray ionization and it was analysed by time of fly (ESI-TOF), and we sequenced the chromosome of couples of strains susceptible/resistant of both species to estimate the genetic changes (mutations) between them, checked by PCR and Sanger sequencing. In this couples we studied the lipid composition in presence and absence of daptomycin and we analysed the thickness of the cell wall by transmission electron microscopy. In S. aureus we demonstrated the resistant strain differed from the rest of the isolates in his high content of lisylphosphatidylglycerol (LPG), a cationic phospholipid. This characteristic was accompanied by the P314L mutation in MprF, protein involved in the synthesis of this phospholipid. We also observed mutations in purR, regulator of the purine metabolism, in the Emb adhesin, and a deletion in an hypothetical protein. The susceptible/resistant couple didn´t adapt his lipid composition to the presence of the antibiotic, and we didn´t observe variation into the thickness cell envelope, which is why we considered that the resistance observed in S. aureus could be related con the mutation P314L. The resistant strains of S. capitis showed important lipid variations compared to the susceptible strain, standing out the low content of LPG and an increase of diacylglycerol (DAG) and free fatty acids (AGL). The chromosomic analysis of the susceptible/resistant couples showed eight mutations in the resistant strain, highlighting the mutations observed in rnJ2, ribonuclease of the degradosome complex, and qacB, gen related with the transport of ammonium ions, but neither of this mutations have been related directly with the lipid synthesis or the homeostasis of the cell envelope. We observed as well that the resistant strain showed an increase of the thickness cell envelope. We checked that both susceptible and resistant strains did not adapt his lipid composition to the presence of the antibiotic in the culture, and this strain had two more carbons in his acyl groups than the susceptible strain. In S. capitis, the daptomycin resistance has a great influence by the lipid membrane composition, without any changes in the genes related with his synthesis or homeostasis, something that we could consider unique in the resistance to this antibiotic.