El silenciamiento génico de Mucor circinelloides regula la cromatina centromérica y la virulencia

Abstract

Desde su descubrimiento en la década de los 90, el silenciamiento génico ha revolucionado el campo de la genética y la biología molecular, donde continúa inspirando investigaciones innovadoras por toda la comunidad científica. Las moléculas de RNA de doble cadena disparan el mecanismo de RNAi, que reconoce los RNAs mensajeros complementarios y dirige su degradación, o bloquea su traducción a proteínas. Un mecanismo de defensa contra ácidos nucleicos invasivos – exógenos o endógenos – en su origen, ha evolucionado a un fenómeno de regulación complejo que no solo protege al genoma, sino que también controla la expresión génica. Para llevar a cabo su función, el mecanismo de RNAi necesita moléculas de RNAs pequeños (sRNAs) que guían a los complejos catalíticos hacia sus dianas por complementariedad de bases. Este mecanismo está conservado en los linajes principales de eucariotas, aunque existen diversas rutas de biogénesis que generan distintos tipos de sRNAs. El reino Fungi es un ejemplo de esta diversidad, ya que encierra numerosas rutas de RNAi implicadas en regular sus ciclos de vida. Este trabajo propone al hongo basal Mucor circinelloides como modelo para estudiar el papel del RNAi en controlar procesos biológicos esenciales para la función cromosómica y la patogénesis. M. circinelloides presenta rutas de RNAi canónicas y no canónicas que interaccionan entre sí para regular la expresión, estabilidad y transmisión de su genoma. Este ubicuo habitante del suelo presenta un estilo de vida saprofítico, pero puede convertirse en un patógeno oportunista de animales causando una infección frecuentemente letal conocida como mucormicosis. En este trabajo se han identificado homólogos conservados del cinetocoro, un puente proteico que une los centrómeros a los microtúbulos durante la división celular. Sorprendentemente, M. circinelloides y todos los Mucorales carecen de la variante centromérica de histonas H3 CENP-A, esencial para unirse a la cromatina centromérica, pero han retenido la mayoría de las proteínas del cinetocoro. Un análisis funcional y ensayo de ChIP-seq contra proteínas conservadas del cinetocoro reveló nueve centrómeros, a los que se anclan los cinetocoros de manera monocéntrica durante todo el proceso de división celular. Los centrómeros en mosaico de M. circinelloides presentan características de centrómeros puntuales definidos genéticamente, como su tamaño pequeño y un motivo de DNA altamente conservado; pero también exhiben rasgos distintivos de centrómeros regionales, principalmente sus enormes regiones pericéntricas colonizadas por retrotransposones. Este retrotransposon es similar a los LINE1 humanos, y está conservado en todas las especies del subfilo Mucoromycotina que carecen de CENP-A. Se denominó Grem-LINE1, y se propone que participa en determinar la identidad centromérica en ausencia de CENP-A. Los Grem-LINE1 están silenciados activamente mediante sRNAs canónicos, lo que indica que el RNAi está implicado en mantener la estabilidad genómica y determinar la identidad centromérica. Además, se ha detectado un aumento de sRNAs canónicos antisentido a los Grem-LINE1 en mutantes que carecen de la ruta de RNAi no canónica (NCRIP), lo que apoya las observaciones previas que apuntaban a una interacción antagonista entre la ruta no canónica sobre la canónica en M. circinelloides. Esta regulación coordinada mediante RNAi juega un papel esencial en la interacción con el sistema inmune innato del hospedador. Al comparar dos patotipos con opuesto potencial virulento, se descubrió una respuesta genética implicada en la supervivencia y germinación durante la fagocitosis por macrófagos. El ambiente hostil del fagosoma dispara esta respuesta, induciendo dos factores de transcripción activadores, Atf1 y Atf2, y remodela una enorme red génica que incluye genes que cifran la aquaporina Aqp1, y dos posibles efectores de secreción o de membrana, Chi1 y Pps1. Estos genes también se inducen in vivo en macrófagos peritoneales de ratón, siendo necesarios para la virulencia en un modelo de infección murino. NCRIP ejerce un control preciso sobre esta respuesta, reprimiéndola durante condiciones no estresantes y liberándola ante un estímulo estresante, como los que la espora encuentra al ser fagocitada. Estos resultados sugieren que la actividad de NCRIP se reprime durante la fagocitosis, correlacionando con un aumento en la expresión de los genes de la ruta canónica de RNAi. Este aumento en la expresión de la ruta canónica de RNAi también se ha observado en los mutantes que carecen de actividad NCRIP. Como consecuencia, los mutantes NCRIP son incapaces de reprimir la respuesta a la fagocitosis y desarrollan una adaptación preexposición a las condiciones estresantes que los protegen frente al daño oxidativo. Esto se manifiesta a nivel transcripcional, ya que el perfil transcriptómico de los mutantes NCRIP en condiciones no estresantes imita al de una estirpe silvestre siendo fagocitada. Sorprendentemente, los mutantes NCRIP son menos virulentos que la estirpe silvestre, sugiriendo que la desregulación de la respuesta a la fagocitosis, ocasionada por la ausencia de actividad NCRIP, afecta a los procesos necesarios para la virulencia. Como conclusión, estos resultados ofrecen un análisis detallado de dos rutas de RNAi que interaccionan en M. circinelloides para regular funciones biológicas esenciales, y arrojan luz sobre su potencial virulento, lo que podría contribuir al desarrollo de terapias contra la mucormicosis.

Since its discovery in the early 1990s, post-transcriptional gene silencing or RNA interference (RNAi) has revolutionized the fields of genetics and molecular biology and continues to inspire groundbreaking research across the scientific community. The presence of double-stranded RNA molecules triggers the RNAi mechanism to recognize and direct degradation of complementary messenger RNAs or prevent their translation into protein. Originally a defense mechanism against invasive nucleic acids –exogenous or endogenous– it has evolved into a complex regulatory phenomenon that not only protects the genome but also controls gene expression. RNAi functionality relies on short RNA molecules (sRNAs) to guide catalytic complexes to their targets by RNA base pairing. This mechanism is conserved in every major eukaryotic lineage, though there are diverse biogenetic pathways that result in different types of sRNAs. The fungal kingdom is an excellent example of this diversity because it encompasses many RNAi pathways involved in controlling the vegetative and sexual stages of their lifecycles. Here in this work, we propose the early-diverging fungus Mucor circinelloides as a model to study the role of RNAi in controlling essential biological processes involved in chromosome function and pathogenesis. M. circinelloides harbors canonical and non-canonical RNAi pathways that are intertwined to regulate genome expression, stability, and transmission, having an impact on its singular ecology. A ubiquitous inhabitant of the soil, M. circinelloides displays a saprophytic lifestyle, but can become an opportunistic animal pathogen and cause an often-lethal infectious disease known as mucormycosis. We identified M. circinelloides conserved homologs of the kinetochore complex, a protein bridge that binds the centromeres to the microtubules during cell division. Surprisingly, M. circinelloides and all of the Mucorales lack the essential centromeric histone H3 variant CENP-A that binds directly to the centromeric chromatin but retain most of the remaining kinetochore proteins. A functional analysis and ChIP-seq assay of conserved kinetochore proteins discovered nine centromeres that anchor kinetochores throughout the cell cycle in a monocentric arrangement. M. circinelloides mosaic centromeres bear features of the genetically-defined point centromeres, like their short length and a highly conserved DNA motif; while also exhibiting regional centromere determining characteristics, mainly their large pericentric regions colonized by a retrotransposable element. This retrotransposon is similar to the human LINE1 and conserved in all species belonging to the subphylum Mucoromycotina that lack CENP-A. Thus, we named it genomic retroelement of Mucoromycotina LINE1-like, or Grem-LINE1, and proposed its involvement in centromere identity in the absence of CENP-A. Grem-LINE1 sequences are being actively silenced by canonical sRNAs, indicating that RNAi is involved in maintaining genome stability and determining centromere identity in M. circinelloides. Intriguingly, there is an increased number of canonical antisense sRNAs targeting Grem-LINE1 sequences in mutants lacking the non-canonical RNAi pathway (NCRIP). Hence, our data support previous observations of an antagonistic interaction of the non-canonical over the canonical RNAi pathway in M. circinelloides. This coordinated RNAi regulation plays a critical role in the interaction with the host innate immune defenses. A comparison between two pathotypes with opposite virulence potentials revealed the genetic response involved in survival and germination during macrophage phagocytosis. The hostile phagosomal environment triggers this response by inducing two basic leucine-zipper activating transcription factors (Atf), Atf1 and Atf2, and remodeling a vast gene network that includes genes encoding an aquaporin aqp1, and two putative membrane-bound or secreted effectors chi1 and pps1. Most of the principal components of this Atf-mediated germination pathway are also induced during in vivo interaction with peritoneal mouse macrophages and are needed for a full virulence in a murine infection model. NCRIP exerts a fine control of this response by repressing it during non-stressful or saprophytic conditions and releasing it upon stressful challenges like those encountered during phagocyte interaction. Our data suggest that NCRIP activity is restrained during macrophage phagocytosis, correlating with an increased expression of the canonical RNAi genes. This increased expression is also observed in mutants lacking NCRIP activity. As a result, NCRIP mutants are unable to repress the response to phagocytosis and develop a constitutive pre-exposure adaptation to stressful conditions that protects them from oxidative damage. This is manifested and explained at a transcriptional level because the transcriptomic profile of these NCRIP mutants cultured under non-stressful conditions mimics most of the wild-type response to macrophage phagocytosis. Surprisingly, the NCRIP mutants are significatively less virulent than a wild-type strain, suggesting that the genetic deregulation provoked by the lack of NCRIP activity affects other fungal processes required for virulence. Overall, our results offer a detailed analysis of how two interacting RNAi pathways in M. circinelloides contribute to essential biological functions and provide insights into its virulence traits, which could lead to therapeutic breakthroughs against the difficult-to-treat mucormycosis.