Estudios moleculares en el género Bombus: análisis depoblaciones y de los mecanismos de defensa en condicionesde estrés térmico e infección por el parásito Crithidia bombi

Abstract

Los abejorros son himenópteros pertenecientes al género Bombus, que se caracterizan por ser eusociales y tener un aspecto particularmente grande y velludo. La mayoría se distribuyen en las zonas templadas, alpinas y árticas de América, Europa y Asia, y como en el caso de otras abejas, están sufriendo un declive global desde mediados del s. XX. Dada su importancia ecológica y económica al usarse como polinizadores comerciales, en esta tesis se han llevado a cabo distintos estudios moleculares con el objetivo general de contribuir a su conservación. En la primera parte de la tesis se ha caracterizado la diversidad de las especies crípticas que conforman el complejo Bombus lucorum en la península Ibérica: B. lucorum y B. magnus. Su distribución en la península no está clara debido a la dificultad de distinguirlas morfológicamente y a la ausencia de estudios moleculares. Por ello, en el primer capítulo se identificaron las especies del complejo B. lucorum en un muestreo de la península Ibérica, con un fragmento del gen citocromo oxidasa subunit 1 (cox1) que funciona como código de barras de ADN para diferenciar especies. Los resultados confirmaron que B. lucorum es una especie relativamente abundante y limitada a la mitad norte peninsular. Además, se encontraron dos individuos de B. magnus, indicando que esta especie es infrecuente en la península y extendiendo su distribución hasta la meseta norte. En el segundo capítulo de la tesis, los individuos de B. lucorum peninsulares se caracterizaron genética y morfológicamente, junto a individuos de Francia y Bélgica. Los resultados del marcador mitocondrial cox1 mostraron una diferenciación de los abejorros del centro de la península que podría ser explicada por la existencia de un refugio glaciar durante el Pleistoceno. Sin embargo, con los marcadores nucleares STRs (microsatélites) y el análisis de la venación de las alas mediante la técnica de la morfometría geométrica no se detectó ninguna diferenciación, indicando que seguramente existe un flujo genético entre las poblaciones al norte de los Pirineos y las del centro peninsular. En la segunda parte de la tesis se estudió la actividad inmunitaria de B. terrestris en condiciones de estrés. En el tercer capítulo se midió la expresión de cinco genes inmunitarios y dos de choque térmico en abejorros en condiciones de calor (38 °C) y de frío (9 °C). El tratamiento con calor aumentó la expresión génica de los genes de choque térmico, pero no modificó significativamente la expresión de los genes inmunitarios. Por otro lado, el tratamiento con frío solo causó el aumento significativo de la expresión del gen BGRP1 relacionado con la respuesta inmunitaria celular. Además, cuando los abejorros se sometieron al estrés añadido de inanición, la expresión de todos los genes aumentó, posiblemente reflejando un efecto de sinergia entre las respuestas a estrés por inanición y por temperatura. En el cuarto capítulo de la tesis se analizó si la microbiota de B. terrestris le protege frente al parásito intestinal Crithidia bombi, estimulando la expresión génica de tres péptidos antimicrobianos (AMPs) y Mucin-5AC, cuya función putativa es la protección del epitelio. Aunque el suplemento de microbiota aumentó la resistencia frente al parásito respecto a los abejorros con microbiota reducida, no se produjo un cambio significativo en la expresión de los genes de AMPs o Mucin-5AC. Sin embargo, sí que se detectó una interacción entre la presencia de Crithidia y el tratamiento con microbiota, observándose un aumento de la expresión de los genes de AMPs cuando los abejorros estaban infectados y recibían un suplemento de microbiota. Por tanto, la microbiota podría interaccionar con el parásito estimulando la respuesta inmune del hospedador, aunque éste mecanismo no explique por sí solo la protección observada.

Bumblebees are hymenoptera species belonging to the genus Bombus and characterised for being eusocial, particularly large and hairy. Most are distributed in temperate, alpine and arctic zones of America, Europe and Asia, and like other bees, they have suffered a global decline since the middle of the XX century. Given their ecological and economic importance as commercial pollinators, different molecular studies have been carried out in this thesis with the general aim of contributing to their conservation. In the first part of this thesis, the diversity of the cryptic species that conform the B. lucorum-complex in the Iberian Peninsula, B. lucorum and B. magnus, has been characterised. Its distribution in the peninsula is not clear because of the difficulty in distinguishing them morphologically and the lack of molecular studies. For this reason, in the first chapter the species of the B. lucorum complex were identified in a sampling throughout the Iberian Peninsula, using a fragment of the cytochrome oxidase subunit 1 (cox1) gene, used as a DNA barcode to differentiate species. Results confirmed that B. lucorum is a relatively abundant species limited to the northern half of the Iberian Peninsula. Additionally, two individuals of B. magnus were found indicating that this species is infrequent and enlarging its distribution to the Northern Plateau. In the second chapter of the thesis, Iberian individuals of B. lucorum were characterised genetically and morphologically together with individuals from France and Belgium. Results from mitochondrial cox1 showed a differentiation of bumblebees in the center of the peninsula that could be explained with the existence of a glacial refugium during the Pleistocene. However, no differentiation was detected with nuclear STRs (microsatellite) and the geometric morphometrics analysis of the wings, pointing to the existence of current genetic flow between the populations north of the Pyrenees and those in the center of the Iberian Peninsula. In the second part of the thesis the immune activity of B. terrestris was studied in stress conditions. In the third chapter, the expression of five immune and two heat shock genes was measured in bumblebees under heat (38 °C) and cold (9 °C) conditions. The heat treatment increased the expression of heat shock genes but did not alter significantly the immune gene expression. On the other hand, the cold treatment only caused a significant upregulation of the gene BGRP1 related to the cellular immune response. In addition, when bumblebees were also submitted to starvation, expression of all genes increased, possibly mirroring a synergy effect between the responses to both starvation and temperature stressors. In the fourth chapter of the thesis, I analysed whether the microbiota of B. terrestris protects against the gut parasite Crithidia bombi through the stimulation of three antimicrobial peptide (AMP) genes and Mucin-5AC, a gene with a putative role in gut epithelium protection. Although the supplemented microbiota increased the resistance against the parasite in comparison with the bumblebees that had reduced microbiota, there was not a significant change in AMP nor Mucin-5AC genes. However, a significant interaction was detected among the presence of Crithidia and the microbiota treatment, where AMP gene expression was higher when bumblebees were infected and received supplemented microbiota. Therefore, the microbiota could interact with the parasite stimulating the immune response in the host, although this mechanism alone does not explain the protective effect observed.