Patrones de expresión génica en especies de insectos modelo y no modelo . Uso de líneas celulares análisis del transcriptoma del sistema inmune

Abstract

Esta tesis se centra en la investigación de diferentes tipos de insectos, con análisis de expresión génica como metodología común. El estudio de especies modelo, no modelo y de importancia económica debe evaluarse de manera diferente en función de la información disponible y la que permanece desconocida. La primera parte incluye los capítulos 1 y 2, centrados en el estudio de líneas celulares de Tribolium castaneum y Ceratitis capitata, dos especies modelo y de importancia económica, y el efecto de varios estímulos/tratamientos en los patrones de expresión génica. La segunda parte se centra en el estudio del transcriptoma de escarabajos tigre, primero validando genes de referencia para la qPCR en el Capítulo 3, y finalmente analizando el transcriptoma inmune de Calomera littoralis y caracterizando nuevos péptidos antimicrobianos en el último. El Capítulo 1 se centra en el escarabajo de la harina Tribolium castaneum, una de las especies de insectos modelo más estudiadas. Caracterizamos el perfil de impedancia con mediante RTCA y estudiamos el efecto del aumento de la temperatura en el crecimiento de la línea celular TcA, expuesta también a choque térmico, aumento de salinidad, pH ácido y luz UV-A con el objetivo de medir los niveles de expresión de los genes Hsp27, Hsp68a y Hsp83. Los resultados muestran una alta termotolerancia de TcA en términos de crecimiento y viabilidad celular, y una regulación positiva de los genes Hsp después de una hora de exposición a 40 ºC y luz ultravioleta. El segundo capítulo se centra en la mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata, una de las especies plaga más peligrosas del mundo. Algunos mecanismos para controlar su presencia incluyen los reguladores de crecimiento de insectos (IGR), centrados en parte en análogos de la hormona juvenil, actuando como un represor del desarrollo y la metamorfosis. La línea celular CCE/CC128 se usó para realizar tratamientos con lipopolisacáridos (LPS) y hormona juvenil III para evaluar la variación del crecimiento celular y los cambios en la expresión de genes con diferentes funciones. Los resultados mostraron un ligero retraso en el crecimiento celular para las células tratadas con JH y una sobreexpresión de Shade, uno de los genes de Halloween miembro de la familia del citocromo p450, implicado en el desarrollo y la síntesis de 20-hidroxiecdisona (20E). El Capítulo 3 se centra en los genes de referencia, normalizadores para los estudios de expresión. Es crucial disponer de un panel de genes de referencia validado para los estudios de expresión en cicindélidos. Nueve genes fueron probados en Cicindela campestris y Calomera littoralis en varias condiciones y sus estabilidades fueron evaluadas con los algoritmos geNorm, NormFinder, BestKeeper y ΔCT. Ningún gen es adecuado para todas las situaciones, pero NADH, B-t, Vatpase y ArgKin parecen presentar la estabilidad de expresión más constante, indicando su idoneidad como genes de referencia en la mayoría de las condiciones. Este es el primer informe que evalúa la estabilidad de los genes de referencia en los escarabajos adéfagos. El último capítulo se centra en el sistema inmune innato de cicindélidos, que podría proporcionar información útil sobre la inmunidad humoral de insectos predadores. El método SSH se realizó en Calomera littoralis para obtener aquellos genes que se sobreexpresaron después de una infección con Escherichia coli. Dos péptidos antimicrobianos conocidos como cecropinas se caracterizaron e identificaron como CliCec-A y CliCec-B2. CliCec-B2 confirmó su actividad antimicrobiana contra algunas bacterias Gram (+) y Gram (-), pero no contra hongos. La expresión de ambas cecropinas aumentó tras una infección y destacó su participación en las mandíbulas de escarabajos adultos, lo que podría estar relacionado con sus hábitos alimentarios.

This thesis focuses on the investigation of different types of insects, with gene expression analysis as a common methodology. Thus, the study of model, non-model, and economical important species needs to be assessed differently based on the information available and the one that remains unknown. The first part includes Chapter 1 and 2, centered in the study of Tribolium castaneum and Ceratitis capitata cell lines, two model and economic important species, and the effect of several stimuli/treatments in gene expression patterns. The second part is focused on the study of tiger beetles transcriptome, first with the validation of reference gene for quantitative PCR in two different species and conditions in Chapter 3, and finally by performing an analysis studying the immune transcriptome of Calomera littoralis and characterising two novel antimicrobial peptides in the last chapter. Chapter 1 is focused on the rust red flour beetle, Tribolium castaneum, one of the most studied insect model species. We characterize the impedance profile with the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer and study the effect of increased temperature in cell growth in the TcA T. castaneum cell line. Additionally, cells are exposed to heat shock, increased salinity, acidic pH and UV-A light with the aim of measuring the expression levels of Hsp27, Hsp68a and Hsp83 genes. Results show a high thermotolerance of TcA in terms of cell growth and viability, and a significant up-regulation of Hsp genes after one hour of exposure to 40 ºC and UV light. The second chapter focus on the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata, known to be among the most dangerous pest species in the world. Some mechanisms for controlling its presence in agriculture include the insect growth regulators (IGRs), centered in part in juvenile hormone analogs, acting as a repressor of development and metamorphosis. In this work, the medfly CCE/CC128 cell line was used to assess lipopolysaccharide (LPS) and Juvenile Hormone III treatments to evaluate cell growth variation and changes in gene expression covering different functions. Results showed a slight retardation in cell growth for those cells treated with JH and an overexpression of Shade after the treatment, one of the Halloween genes member of the cytochrome p450 family, involved in development and the synthesis of 20-hydroxyecdysone (20E). Chapter 3 focus on reference genes, used as normalizers for expression studies. Considering the interest that tiger beetles have generated in the past years, it is crucial to dispose of a validated reference gene panel for expression studies. Nine candidate genes were tested in Cicindela campestris and Calomera littoralis across several conditions and their stabilities were assessed with geNorm, NormFinder, BestKeeper and ΔCT method algorithms. No universal gene is found to be suitable for all situations, but NADH, B-t, Vatpase and ArgKin seem to present the most constant expression stability, indicating their suitability as reference genes in most conditions. This is the first report evaluating the stability of housekeeping genes in adephagan beetles. Last chapter focuses on the innate immune system in tiger beetles, which could provide useful information about humoral immunity of predatory insects. SSH method was performed in Calomera littoralis beetles to obtain those genes that were overexpressed after an infection with Escherichia coli. Two cecropin antimicrobial peptides were characterized and identified as CliCec-A and CliCec-B2. CliCec-B2 confirmed cecropins antimicrobial activity against some Gram (+) and Gram (-) bacteria, but not against yeast. Expression of both cecropins showed increases after an infection and highlighted their involvement in adult beetle mandibles, which could be related to their alimentary habits.