Análisis genómico y transcriptómico de caracteres ligados a la calidad del fruto en Albaricoquero

Abstract

El albaricoquero (Prunus armeniaca L.) es uno de los cultivos con mayor valor agronómico a nivel mundial, destacando su fruto por su calidad gustativa muy apreciada por el consumidor y como un alimento funcional con propiedades nutricionales y bioactivas, notablemente beneficioso para la salud humana. La adquisición de los caracteres de calidad tiene lugar durante la fase final de maduración del fruto, el cual es un proceso coordinado en el que se produce un cambio en la expresión de cientos a miles de genes, modificando numerosos procesos bioquímicos y fisiológicos que darán lugar a los rasgos característicos de calidad del fruto. En este contexto, la mejora de la calidad del fruto es uno de los objetivos prioritarios a conseguir en las nuevas variedades desarrolladas por los programas de mejora genética del albaricoquero. El objetivo de esta Tesis Doctoral es avanzar en el análisis genómico y transcriptómico de los mecanismos moleculares implicados en la expresión de caracteres asociados a calidad del fruto en albaricoquero a fin de identificar y validar genes candidatos ligados a la expresión de caracteres de calidad para posibilitar el desarrollo de marcadores moleculares específicos, aplicables a la selección asistida en los programas de mejora de la especie. Desde el punto de vista genómico, dos poblaciones segregantes fueron fenotipadas y genotipadas. Se saturó con nuevos marcadores de ADN los Grupos de Ligamiento (GLs) 3 y 4, donde trabajos anteriores habían localizado Quantitative Trait Loci (QTL) para caracteres ligados a calidad del fruto, permitiendo la identificación de QTLs significativos vinculados a rasgos fenológicos y de calidad del albaricoque, la identificación de genes candidatos y la validación biológica de estos QTL a través del análisis de expresión génica mediante el uso de qRT-PCR. En el análisis QTL, los resultados más relevantes muestran QTLs muy significativos ligados al color de la piel del fruto en GL3 y a la fecha de maduración en GL4. Es destacable la co-localización NAC cerca del QTL de fecha de maduración en el GL4; y un gen que codifica un factor de transcripción MYB10 cerca del QTL de color de la piel en el GL3. El análisis de ambos genes mediante el uso de qRT-PCR valida estos análisis QTLs. En una segunda etapa, los transcriptomas de dos genotipos de albaricoque de la misma población segregante F1 con características fenotípicas divergentes fueron secuenciados (RNA-Seq) en tres etapas de desarrollo durante la maduración del fruto. Varios genes son propuestos como genes candidatos implicados en las rutas de biosíntesis de fenilpropanoides, flavonoides, antocianinas y carotenoides; el metabolismo del almidón y la sacarosa; los transportadores de metabolitos secundarios; la degradación de la pared celular y la pérdida de firmeza; el metabolismo del etileno; la degradación de las clorofilas; y los factores de transcripción y los reguladores del crecimiento que intervienen en la regulación del proceso de maduración. De este análisis, los genes candidatos DIOXIGENASA DE CAROTENOIDES 4 y una SACAROSA SINTASA han sido validados como genes clave en el color amarillo claro/blanco del fruto y el alto contenido de sólidos solubles. Finalmente, fue analizada la dinámica de expresión de los genes candidatos obtenidos a partir de los resultados de QTLs y RNA-Seq fue analizada durante el proceso de maduración del fruto en nueve variedades de referencia de albaricoquero que reúnen una gran variabilidad en el color de piel y pulpa, fecha de maduración, acidez y firmeza del fruto. La construcción de modelos de regresión lineal múltiple (MLR) para el contenido de antocianinas y carotenoides permitió la evaluación de los genes que tenian una mayor influencia dentro del modelo, siendo estos genes candidatos clave durante la biosíntesis de los metabolitos estudiados o la regulación del proceso de maduración. Como resultado, se ha obtenido un modelo con un alto porcentaje de explicación y ajuste adecuado para la biosíntesis de carotenoides. Los genes CHALCONA SINTASA y 4-CUMARATO-COA LIGASA, implicados en la biosíntesis de antocianinas, se describen como genes clave en el contenido de antocianinas; mientras que la DIOXIGENASA DE CAROTENOIDES 4, responsable de la degradación de los carotenoides y cuya expresión está ligada al color amarillo claro del fruto, junto con la ZETA-CAROTENO DESATURASA, se validan como genes clave para el contenido de carotenoides y el color del fruto. En relación con el proceso de maduración, la LIPOXIGENASA 2 y el factor de transcripción MADS-BOX se proponen como genes candidatos para el seguimiento de la progresión del proceso de maduración en el albaricoque. A partir de los resultados obtenidos en este análisis genómico-transcriptómico integrado, el siguiente paso será identificar polimorfismos genéticos en estos genes candidatos vinculados a polimorfismos fenotípicos, con el fin de desarrollar marcadores de ADN específicos para su uso en la selección asistida por marcadores moleculares (marker-assisted selection, MAS), y así aumentar la eficiencia de los programas de mejora de albaricoquero mediante la selección precoz de genotipos con alta calidad del fruto.

Apricot (Prunus armeniaca L.) is a valuable worldwide agronomical crop, highlighting its fruit for its delightful taste, very appreciated by the consumers as functional food with both nutritional and bioactive properties, remarkably beneficial to human health. The acquisition of apricot fruit quality traits takes place during the last stages of ripening process, which is a coordinated process where a change in expression of hundreds to thousands genes happens to modify many biochemical and physiological processes arising its characteristic quality traits in ripe fruit. In this context, enhance fruit quality is one of the priority objectives to be reach in the new varieties developed by apricot breeding programmes. The objective of this PhD Thesis is to advance in the genomic and transcriptomic analysis of the molecular mechanisms involved in the expression of traits associated with fruit quality in apricot species in order to identify and validate candidate genes linked to the expression of fruit quality traits to enable the development of specific molecular markers applicable to marker-assisted selection (MAS) in apricot breeding programmes. From the genomic approach, two segregating progenies were phenotyped and genotyped. The saturation with new DNA markers the Linkage Groups (LGs) 3 and 4, where previous works located QTLs linked to fruit quality traits, allowed the identification of significant QTLs associated to phenological and quality traits in apricot, the identification of candidate genes and the biological validation of these QTLs through the gene expression analysis by using qRT-PCR. In the QTL analysis, the most relevant results show very significant QTLs linked to fruit skin colour in the LG3, and ripening date in the LG4. It is noted the co-location of a NAC transcription factor nearby the QTL for ripening date in the LG4; and a gene encoding for a MYB10 transcription factor nearby the QTL for skin colour in the LG3. The analysis of both genes by using qRT-PCR validate these QTLs analyses. In a second stage, the transcriptomes of two apricot genotypes from the same segregating progeny F1 which differ in phenotypic characterization, were sequenced at three developmental stages during fruit ripening. Several candidate genes are proposed as key genes for biosynthetic pathways of phenylpropanoids, flavonoids, anthocyanins and carotenoids biosynthesis; starch and sucrose metabolism; secondary metabolites transporters; cell wall degradation and firmness loss; ethylene metabolism; chlorophylls degradation; and transcription factors and growth regulators involved in the regulation of the ripening process. CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 4 and SUCROSE SYNTHASE are validated as key genes for light yellow/white fruit colour and high soluble solids content at the ripening process. Finally, the expression dynamics of candidate genes obtained from QTLs and RNA-Seq results were monitored during the fruit ripening process in nine reference cultivars which gathered a large variability in skin colour and flesh colour, ripening date, acidity and firmness. The construction of multiple linear regression (MLR) models for anthocyanins and carotenoids content allowed the evaluation of which genes have the greatest influence within the model, as these candidate genes are key genes during metabolites biosynthesis or ripening process regulation. As a result, a model with a high percentage of explanation and proper adjustment to the data for carotenoid biosynthesis was obtained. The genes CHALCONE SYNTHASE and 4-COUMARATE-COA LIGASE, involved in anthocyanins biosynthesis, are described as key genes for anthocyanins content; while CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENSASE 4, responsible for carotenoids degradation and which expression is linked to light yellow flesh fruit colour, together with ZETA-CAROTENE DESATURASE, are validated as key genes for carotenoids content and fruit colour. In relation to the ripening process, LIPOXYGENASE 2 and MADS-BOX transcription factor are proposed as candidate genes for monitoring the progression of the ripening process in apricot fruit. From the results obtained in this integrated genomic-transcriptomic analysis, the next step will be to identify genetic polymorphisms in these candidate genes linked to phenotypic polymorphisms, in order to develop DNA markers for their use in marker-assisted selection (MAS) to increase the efficiency of apricot breeding programmes by the early selection of high-quality fruit genotypes.