Aproximación fisiológica para la optimización del sistema de producción de embriones in vitro en la especie porcina

Abstract

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es la aproximación de las condiciones de IVF y EC a las registradas en el tracto reproductor de la cerda para la mejora de la producción in vitro de embriones en la especie porcina. Con este fin, se realizaron cuatro experimentos. Los dos primeros consistieron en la modificación de los medios de cultivo utilizados durante la IVF y el EC mediante la adición de proteínas específicas o fluidos naturales presentes en el oviducto y el útero de la cerda. Los dos últimos experimentos consistieron en obtener in vivo los valores de referencia para parámetros físico-químicos como el oxígeno y temperatura del interior de los órganos reproductores de la cerda, y transferirlos a las condiciones in vitro. En el primer experimento, ovocitos porcinos madurados in vitro fueron incubados en un medio con heparina, ezrin, HSP-70-1A o HSP-90α a excepción del grupo control. Estos mismos grupos fueron utilizados durante la IVF. Los resultados mostraron que heparina y cada una de las proteínas por sí mismas eran capaces de endurecer la zona pelúcida de los ovocitos porcinos, es decir, aumentar los tiempos de digestión para la zona pelúcida. La combinación de heparina con cada una de las proteínas aumentó esos tiempos, excepto para HSP-90α donde disminuyó. Aunque prometedores, ya que el efecto de heparina y cada una de las proteínas añadidas al medio de IVF redujeron las tasas de polispermia, los resultados también mostraron bajas tasas de penetración cuando estas moléculas fueron añadidas a los medios, de manera que no se consiguió la mejora de la técnica de IVF con este enfoque. En el segundo experimento se compararon dos métodos de selección espermática. Uno de los métodos más utilizados para la especie porcina, centrifugación a través de un gradiente de densidad, se comparó con un nuevo procedimiento que hizo que los espermatozoides nadaran en un tubo que contenía un medio de cultivo con o sin fluido oviductal porcino (POF) con la intención de imitar los cambios sufridos por los espermatozoides en su ascenso por el tracto reproductor femenino. Por otro lado, se compararon dos sistemas de producción de embriones. Un nuevo sistema de cultivo, donde se añadió de forma secuencial POF al medio de IVF, y POF y fluido uterino porcino (PUF) a los medios de EC, frente a un sistema de producción de embriones donde no se añadió estos fluidos a los medios. Los resultados indicaron que la utilización de swim-up como método de selección espermática para la producción de embriones porcinos alcanzó el 40 % de rendimiento, indicando una mejora con respecto a los mejores resultados previos registrados en cerdos (30 -35 %). Además, ese valor incrementó un 5 % cuando los fluidos reproductivos fueron añadidos a los distintos medios de cultivo, superando incluso el valor de rendimiento dado para la especie bovina. Igualmente, la adición de los fluidos a los medios mejoró la calidad de los embriones obtenidos, alcanzando un número medio de células similar al de embriones obtenidos in vivo. En el tercer y cuarto experimento se realizaron una serie de mediciones de oxígeno y temperatura en el tracto reproductivo de cerdas adultas y cerdas pre-púberes, en distintas fases del ciclo estral, usando técnicas de cirugía y sondas mínimamente invasivas. A continuación, los valores obtenidos se transfirieron a las técnicas de IVF y EC, con el propósito de mejorar la producción de embriones porcinos in vitro. El tercer experimento reveló por primera vez la cantidad de oxígeno dentro de los órganos reproductivos de la cerda adulta (7 %), siendo este valor mayor (10 %) para cerdas pre-púberes tratadas con hormonas. Se observaron dos perfiles para las medidas de oxígeno: perfil plano, donde la variación de oxígeno fue mínima respecto al promedio, y un perfil ondulado que presentó pequeñas variaciones (±2) respecto al promedio. El perfil ondulado fue asociado al útero. El uso de condiciones de hipoxia (7 % oxígeno) durante la IVF seguido del EC mejoró la producción de embriones porcinos y la calidad de los blastocistos obtenidos. En el cuarto experimento se demostró la existencia de un gradiente de temperatura entre oviducto (37.0 ºC) y útero (38.7 ºC) por primera vez. La transferencia de ese gradiente durante las técnicas de IVF y EC mejoró la producción de embriones in vitro en la especie porcina a través de la reducción de los ratios de polispermia. El uso de una temperatura elevada (39.5 ºC) durante la IVF ejerció el efecto contrario al uso de una temperatura baja (37.0 ºC), ya que aumentó los ratios de polispermia y se pudo intuir una mayor fragmentación de los embriones producidos a esa temperatura. La obtención de la temperatura de transición para espermatozoides capacitados de verraco (37.0 ºC), así como la incubación de esos espermatozoides a distintas temperaturas (37.0 ºC, 38.5 ºC y 39.5 ºC) determinó un papel relevante de ésta en la remodelación de los lípidos de la membrana plasmática del espermatozoide y su implicación en la IVF.

The objectives of this PhD Thesis are approaching the IVF and CE conditions to those recorded in the sow's reproductive tract for the improvement of the in vitro production of porcine embryos. To this end, four experiments have been carried out. The first two consisted of the modifications in the culture media used during IVF and CE by adding either specific proteins or natural fluids present in the oviduct and uterus of sows. The last two experiments consisted of obtaining in vivo, inside the reproductive organs of the female pig, the reference values for physical-chemical parameters such as oxygen and temperature, and transfer them to in vitro conditions. In the first experiment, porcine oocytes matured in vitro were incubated in a medium with heparin, ezrin, HSP-70-1A or HSP-90α. These same groups were used during IVF since heparin or proteins were added to the IVF medium with the oocytes and spermatozoa. In the control groups, gametes were incubated in a medium without heparin nor proteins. The results showed that heparin and each of the tested proteins hardened the ZP of the porcine oocytes, by increasing its resistance to enzymatic digestion. The combination of heparin with each of the proteins increased such hardening effect, except for HSP-90α, where the the ZP´s resistance was reduced. While promising, since the effect of heparin and each of the proteins added into the IVF medium drafted the polyspermy rates, IVF outcome was not improved because of the reduction in the penetration rates. In the second experiment, two sperm selection methods were compared. One of the widely used procedures in swine, the density gradient centrifugation, was compared with a new procedure, which made the sperm swam up in a tube containing culture media with or without porcine oviductal fluid (POF). On the other hand, two IVEP systems were compared. A new system containing POF and porcine uterine fluid (PUF) within the culture media during IVF and EC was compared with a system where those biofluids were not added to the culture media. The results indicated that the use of swim-up as sperm selection procedure for the production of porcine embryos reached a 40% yield, indicating an improvement with regard to the best results obtained in pigs up to date (30-35%). Furthermore, that value increased in a 5% when the reproductive fluids were added to the different culture media, even surpassing the value of the yield given for the bovine species. Likewise, the addition of the fluids to the media improved the quality of the porcine in vitro embryos produced, which achieved a mean number of cells similar to porcine embryos collected in vivo. In the third and fourth experiments, a series of measurements of oxygen and temperature were made in the reproductive tract of sows and gilts at different phases of the estrous cycle, using minimally invasive surgery techniques and new probes. The values obtained were then transferred to IVF and CE procedures, with the purpose of improving the production of porcine embryos in vitro. The third experiment revealed the amount of oxygen within the reproductive organs of sow (7%), being higher in gilts treated with hormones (10%). Two profiles for oxygen measurements were observed: a flat profile, where the oxygen variations were minimal with respect to the average, and a wavy profile, which showed small variations (± 2) with respect to the average. The wavy profile was associated with the uterus. The use of hypoxia conditions (7% oxygen) during IVF followed by EC improved porcine IVEP outcome and the quality of the porcine blastocysts obtained. In the fourth experiment was demonstrated the existence of a temperature gradient between the oviduct (37.0 ºC) and uterus (38.7 ºC) for the first time. Transferring this gradient during IVF and CE improved the production of in vitro embryos in the porcine species through the reduction of the polyspermy rates. In addition, the use of a high temperature (39.5 ºC) during IVF exerted the opposite effect to the use of a low temperature (37.0 ºC), since its use increased the polyspermy rates, and a greater fragmentation of the embryos obtained at high temperature was observed. On the other hand, obtaining the transition temperature for capacitated boar sperm (37.0 ºC), as well as the incubation of these spermatozoa at different temperatures (37.0 ºC, 38.5 ºC and 39.5 ºC), indicated an important role of temperature in the remodelling of the lipids contained in the sperm membrane and its implication in IVF.