Nuevos marcadores de estrés oxidativo en perros. Aspectos técnicos y aplicaciones prácticas

Abstract

Los objetivos de esta tesis doctoral fueron aumentar el conocimiento sobre el posible uso y aplicaciones de los diferentes ensayos que pueden utilizarse para la determinación de la Capacidad Antioxidante Total (TAC) en perros y validar nuevos ensayos espectrofotométricos para evaluar TAC en suero de perros. Además, se buscó proporcionar una visión general de cómo el TAC medido por diferentes ensayos y otros marcadores de estrés oxidativo pueden comportarse en diferentes enfermedades del perro. Finalmente, se estudió la estabilidad de los diferentes ensayos de TAC, así como otros biomarcadores de estrés oxidativo en suero canino. En primer lugar, se investigaron los principales ensayos espectrofotométricos (capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox [TEAC], capacidad antioxidante de reducción del ión cúprico [CUPRAC] y capacidad de reducción férrica del plasma [FRAP]) utilizados para evaluar el TAC en muestras de fluidos de perros mediante la revisión de la base metodológica de cada uno, su aplicación práctica en la determinación de TAC, y también proporcionar información existente en humanos para un fin comparativo. Posteriormente, se validó en suero de perro un ensayo automatizado para medición de CUPRAC, basado en la reducción de Cu2+ en Cu1+ por la acción de los antioxidantes no enzimáticos presentes en la muestra, tres ensayos automatizados para mediciones de TEAC, basados en la capacidad de una muestra para reducir el radical ABTS, y un ensayo automatizado para la medición de FRAP, basado en la capacidad de los antioxidantes presentes en la muestra para reducir la forma férrica (Fe3+) a su forma ferrosa (Fe2+). Para estudiar la aplicación de los marcadores de estrés oxidativo en diferentes enfermedades del perro, se utilizaron perros enfermos infectados naturalmente por leishmaniosis canina, perros con enfermedad inflamatoria intestinal idiopática (IBD), perros con ehrlichiosis (CME) clínica y subclínica y perros con dermatitis atópica (AD) inducida y no inducida por alimentos. Por último, seis pools de suero de perros sanos se dividieron en varias alícuotas y se almacenaron a 4°C y 25°C durante un período de 6, 24 y 72 h, y a -20°C y -80°C durante un período de 7, 14, 30, 60, 180 y 360 días. Además, se evaluó el efecto del ciclo de congelación-descongelación repetido. Los métodos validados permitieron la determinación de TAC con buena precisión, sensibilidad y exactitud y detectaron bajas concentraciones de este analito en la inflamación y la infección. Cuando se evaluaron biomarcadores en diferentes enfermedades, el TEAC, CUPRAC y el tiol total disminuyeron en suero de perros con leishmaniosis. Además, CUPRAC y tiol aumentaron después del tratamiento contra esta enfermedad. Los perros con IBD tenían una disminución del TEAC, CUPRAC y tiol total, y un aumento de biomarcadores oxidantes en el suero como FOX, TBARS y ROS. Los perros con CME clínica mostraron disminución de CUPRAC, FRAP, TEAC y tiol total y aumento de ROS. En el caso de CME subclínica, todos los biomarcadores presentaron diferencia entre perros enfermos y sanos con excepción del TEAC. En el caso de perros con AD, estos presentaron concentraciones disminuidas de CUPRAC, TEAC y tiol total y aumentadas de FRAP y de FOX en comparación con perros sanos. En el estudio de estabilidad, la mayoría de analitos fueron estables hasta 24 horas a 4ºC. En caso de almacenamiento a largo plazo, el uso de -80ºC proporcionó una mejor estabilidad que a -20ºC. Además, todos los biomarcadores se vieron afectados por tres ciclos de congelación-descongelación. Los ensayos automatizados validados en esta Tesis para la determinación de TAC en muestras de suero canino son simples, rápidos y fáciles de realizar, y se pueden adaptar fácilmente a analizadores bioquímicos automatizados. Se recomienda utilizar un panel integrado por una combinación de ensayos de TAC para evaluar el estado antioxidante de una muestra, ya que los resultados de TAC pueden ser marcadamente diferentes dependiendo del ensayo realizado. Cuando se evaluaron biomarcadores del estrés oxidativo en diferentes enfermedades del perro, como la leishmaniosis, la IBD, la CME y la AD, se observó que cada enfermedad presentaba cambios particulares en los biomarcadores evaluados. Además, en el caso de la leishmaniosis canina algunos biomarcadores como CUPRAC y tiol fueron útiles para la monitorización del tratamiento. Como los biomarcadores oxidativos individuales pueden mostrar diferencias en la estabilidad, es importante tener en cuenta las condiciones de almacenamiento y el analito a medir cuando se van a usar muestras almacenadas. The objectives of this PhD thesis were to increase the knowledge about the possible use and applications of the different assays that can be used for Total Antioxidant Capacity (TAC) determination in dogs and to validate new different spectrophotometric assays to evaluate TAC in serum of dogs. In addition, we wanted to provide an overview of how TAC measured by different assays and others biomarkers of oxidative stress can behave in different diseases in dogs. Finally, the stability of the different TAC assays as well as other oxidative stress biomarkers in canine serum was studied. First, the main spectrophotometric assays (Trolox equivalent antioxidant capacity [TEAC], cupric reducing antioxidant capacity [CUPRAC] and ferric reducing ability of plasma [FRAP]) used in dogs to evaluate the TAC in fluid samples were investigated by reviewing the basis of each one, their practical application in the determination of TAC in dogs, and also providing selected information about reports in humans for comparative purposes. Subsequently, an automated assay for CUPRAC measurement, based on the reduction of Cu2+ into Cu1+ by the action of the non-enzymatic antioxidants presented in the sample, three automated assays for TEAC measurements, based on the ability of a sample to reduce ABTS•+, and one automated assay for FRAP measurement, based on the ability of the antioxidants present in the sample to reduce ferric (Fe3+) to its ferrous (Fe2+) form, were validated for use in serum of dogs. The behaviour of the different biomarkers of oxidative stress in different canine diseases was assessed by using sick dogs naturally infected by canine leishmaniosis, dogs with inflammatory bowel disease (IBD), dogs with clinical and subclinical ehrlichiosis (CME), and dogs with non-food and food-induced atopic dermatitis (AD) were used. Last, six serum pools from healthy dogs were divided in various aliquots and stored at 4º C and 25 ºC for a period of 6, 24 and 72 h, and at -20 ºC and -80 ºC for a period of 7, 14, 30, 60, 180, and 360 days. In addition, the effect of repeated freeze-thaw cycle was evaluated. The methods validated allowed the TAC determination in a precise, accurate and sensitive way and detected decreased concentrations of this analyte in inflammation and infection disease. When individual biomarkers were evaluated in different diseases, serum TEAC, CUPRAC, and total thiol were decreased in dogs with leishmaniosis. In addition, CUPRAC, and thiol increased after treatment against this disease. Dogs with IBD had decreased serum TEAC, CUPRAC, and total thiol, and increased oxidant biomarkers in serum such as FOX, TBARS and ROS. Dogs with clinical CME showed decreased CUPRAC, FRAP, TEAC and total thiol and increased ROS. In the case of subclinical CME all the biomarkers were also different from the healthy dogs with exception of the TEAC. Oxidative stress also may play a role in the pathogenesis of AD in dogs, which had decreased concentrations of serum CUPRAC, TEAC, and total thiol and increased FRAP, and increased FOX when compared with healthy dogs. In relation to the stability study, most of the analytes were stable for up 24 h at 4 ºC. In case of long-term storage, the use of -80 ºC provides a better stability than at -20 ºC. In addition, all biomarkers are affected by three freeze-thaw cycles. The automated assays validated in this Thesis for TAC determination in canine serum samples are simple, fast, and easy to perform, and can be easily adapted to automated biochemical analysers. A panel integrated by a combination of TAC assays should be used for evaluation of antioxidant status of a sample, because the results of TAC could be markedly different depending on the assay performed. When oxidative stress biomarkers were evaluated in different diseases of the dog such as leishmaniosis, IBD, CME and AD, it was observed that each disease had particular changes in the biomarkers evaluated. In addition, in the case of canine leishmaniosis some biomarkers such as CUPRAC and thiol were useful for treatment monitoring. As individual oxidative biomarkers can show differences in stability, it is important to consider the storage conditions of each analyte when stored samples are used.