Estudio in vitro del efecto de las células madre mesenquimales de líquido amniótico sobre la función plaquetaria

Abstract

Introducción: Las células madre mesenquimales (CMM) obtenidas a partir de tejidos extraembrionarios, respresentan una nueva fuente de células madre para su uso en terapia celular. Están exentas de los problemas éticos y potencial tumorogénico asociados a las células madre embrionarias. Y respecto a las células madre adultas, presentan una mayor capacidad de proliferación y de diferenciación. Una de las fuentes de las CMM es el líquido amniótico, las cuales han demostrado tener excelentes propiedades inmunomoduladoras, antiinflamatorias, así como baja inmunogenicidad y teratogenicidad en transplantes in vivo. Recientemente, se han descrito efectos secundarios, principalmente fenómenos trombóticos cuando se administran las CMM por vía intravenosa. Estos efectos adversos se han relacionado con una mayor expresión del factor tisular, el cual activaría la vía extrínseca de la coagulación produciendo finalmente trombina. Se ha visto como las CMM interactúan con otras células, entre ellas las plaquetas, elementos con un papel fundamental en la hemostasia. Objetivos: El objetivo prinicpal es evaluar el efecto in vitro de las células madre mesenquimales de líquido amniótico (CMM-LA) sobre la función plaquetaria. Como objetivos secundarios nos planteamos el aislamiento, cultivo, caracterización de CMM-LA obtenidas de partos a término, analizar el efecto de las CMM-LA sobre la agregación y adhesión, evaluar el efecto de las CMM-LA sobre la expresión de marcadores de activación plaquetaria y el estudio del efecto de las CMM-LA sobre los niveles citoplasmáticos del calcio plaquetario. Material y métodos: las CMM se obtuvieron de líquidos amnióticos (LA) de cesáreas programadas de partos a término. Posteriormente se cultivaron en medio Amniomed, realizando un seguimiento del cultivo cada 48-72 horas. A los 30 días, se evaluó su capacidad de diferenciación a condrocitos, adipocitos y osteocitos, así como su identificación realizando la caracterización fenotípica. Así mismo se llevó a cabo el análisis molecular de las CMM-LA. En cuanto al análisis del efecto de las CMM-LA sobre la función plaquetaria se realizaron los ensayos clásicos de PFA-100 y Multiplate. Por citometría de flujo también se analizó el efecto de las CMM-LA sobre la agregación plaquetaria, sobre la expresión de marcadores de activación plaquetaria y sobre los niveles citoplasmáticos del calcio plaquetar. Resultados: Los cultivos de CMM-LA mostraron alta proliferación, capacidad de diferenciación y expresaron los maracadores mesenquimales CD105+, CD90+ y CD73+ y los factores de la coagulación y adhesión: factor VIII, factor de von Willebrand, factor tisular y podoplanina, siendo negativas para los marcadores hematopoyéticos CD45- y CD34-. En cuanto al estudio del efecto de las CMM-LA sobre la función plaquetaria, no se observaron diferencias por el analizador PFA-100. Por el contrario, el sistema Multiplate y el análisis por citometría de flujo sí mostraron cambios en la agregación y activación plaquetaria (expresión de P-selectina) tanto basalmente como en presencia de agonistas. Al evaluar el calcio plaquetario por citometría de flujo, observamos como la presencia de CMM-LA produce un ligero aumento de calcio citoplasmático en las plaquetas aisladas, mantenido solo en presencia de calcio extracelular, por el contrario las plaquetas que si interaccionan con las CMM-LA mostraron un progresivo y significativo aumento del calcio citoplasmático. Al realizar los mismos experimentos con heparina, cuya función es inhibir la producción de trombina, se observaron cambios significativos en la agregación, donde se observó una reducción de la respuesta, en la activación donde se disminuyó aún más la expresión de P-selectina, y en el aumento de calcio citoplasmático plaquetario de los agregados. Conclusiones: El líquido amniótio obtenido de partos a término es una fuente adecuada para la obtención de CMM. Las CMM-LA inducen cambios en la función plaquetaria, independientemente de sus efectos procoagulantes.

Introduction: Mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from extraembryonic tissues, represent a new source of stem cells for use in cell therapy. They are exempt from the ethical problems and tumorigenic potential associated with embryonic stem cells. Moreover, with respect to adult stem cells, they have a greater capacity for proliferation and differentiation. One of the sources of MSCs is amniotic fluid, which have shown to have excellent immunomodulatory, anti-inflammatory properties, as well as low immunogenicity and teratogenicity in in vivo transplants. Recently, side effects have been described, mainly thrombotic phenomena were administered intravenously. These adverse effects, have been related to a greater expression of tissue factor, which would activate the extrinsic coagulation pathway, ultimately producing thrombin. It has been seen how MSCs interact with other cells, including platelets, elements with a fundamental role in hemostasis. Objectives: The main objective is to evaluate the in vitro effect of amniotic fluid mesenchymal stem cells (MSCs-LA) on platelet function. As secondary objectives we consider the isolation, culture, characterization of MSCs-LA obtained from term births, analyze the effect of the MSCs -LA on the aggregation and adhesion, evaluate the effect of the MSCs-LA on the expression of activation markers platelet and the study of the effect of the MSCs -LA on the cytoplasmic levels of platelet calcium. Material and methods: MSCs were obtained from amniotic fluids (LA) of scheduled cesarean deliveries at term. Later they were cultivated in Amniomed medium, monitoring the culture every 48-72 hours. After 30 days, their capacity for differentiation into chondrocytes, adipocytes and osteocytes was evaluated, as well as their identification by phenotypic characterization. Likewise, the molecular analysis of the MSCs-LA was carried out. Regarding the analysis of the effect of the MSCs -LA on the platelet function, the classic PFA-100 and Multiplate trials were carried out. The effect of MSCs-LA on platelet aggregation, on the expression of platelet activation markers and on the cytoplasmic levels of platelet calcium was also analyzed by flow cytometry. Results: The cultures of MSCs-LA showed high proliferation, differentiation capacity and expressed the mesenchymal markers CD105+, CD90+ and CD73+ and the factors of coagulation and adhesion: factor VIII, von Willebrand factor, tissue factor and podoplanin, being negative for the hematopoietic markers CD45- and CD34-. No differences were observed by PFA-100 analyzer. By the other way, the Multiplate system and the flow cytometric analysis did show changes in aggregation and platelet activation (expression of P-selectin) both basally and in the presence of agonists. When evaluating platelet calcium by flow cytometry, we observed how the presence of MSCs-LA produces a slight increase in cytoplasmic calcium in isolated platelets, maintained only in the presence of extracellular calcium. On the contrary, platelets that interact with MSCs-LA showed a progressive and significant increase in cytoplasmic calcium. heparin potentiate the inhibition of the aggregation and activation in platelets. Conclusions: The amniotic fluid obtained from term deliveries is an adequate source for obtaining MSCs. MSCs-LA induce changes in platelet function, regardless of their procoagulant effects.