Caracterización de las rutas de MAP Quinasas de respuesta a estrés e integridad celular, y su interacción funcional con otras vías de señalización intracelular en Schizosaccharomyces pombe

Abstract

Las proteínas quinasas C (PKCs) juegan un papel esencial durante la regulación de numerosos procesos fisiológicos en los organismos eucariotas. La levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe posee dos ortólogos a PKC, Pck1 y Pck2, que actúan aguas arriba del módulo de MAP quinasas de integridad celular regulando la morfogénesis y la biosíntesis de la pared celular. Los resultados revelaron que, pese a su fuerte similitud estructural y redundancia funcional, los mecanismos que regulan la maduración, activación y estabilización de ambas quinasas tienen un impacto biológico notablemente distinto. Así, la fosforilación in vivo de Pck1 en el bucle de activación y en los motivos de giro e hidrofóbico es esencial para su estabilidad y funciones biológicas. Por el contrario, Pck2 es parcialmente funcional independientemente de su actividad catalítica. Sorprendentemente, la activación constitutiva promueve la desfosforilación y la desestabilización de Pck2, mientras que aumenta los niveles de Pck1, lo que provoca un fenómeno de interferencia de la señalización aguas abajo hacia la ruta de integridad celular dependiente de Pck2. Estos resultados indican que la evolución temprana a partir de un antepasado común implicó cambios importantes en los mecanismos que regulan la activación catalítica y la estabilidad de los miembros de la familia PKC, lo que permitiría un control flexible de sus funciones biológicas, incluyendo señalización por rutas de MAP quinasas. Las rutas TOR desempeñan un papel clave en el control del crecimiento y envejecimiento celular, y su disfunción provoca enfermedades como el cáncer, obesidad y diabetes. Hemos utilizado un enfoque multidisciplinar que combina técnicas genéticas, bioquímicas, y de biología celular, con el fin de estudiar las interacciones funcionales de las rutas de integridad celular (CIP) y TOR durante el control del crecimiento y la respuesta celular frente al estrés. Nuestros resultados sugieren que Rhy1, la GTPasa activadora del complejo TORC2 en S. pombe, activa la ruta CIP mediante dos mecanismos distintos. El primero incluye a los complejos TORC2-Gad8 y TORC1-Psk1, que promueven la síntesis de Pck2 en respuesta al estrés inducido por daño en la pared celular o tras el ayuno de glucosa. En el segundo mecanismo Ryh1 activa a la MAPK Pmk1 de forma independiente de TORC2, regulando la localización y/o tráfico en la membrana plasmática de activadores de la ruta como la PDK Ksg1 y el GEF Rgf1. Por último, Pmk1 actúa aguas arriba de Ryh1 para inhibir la señalización de TORC2 en respuesta a estrés. La coordinación de las rutas TOR y de MAP quinasas de integridad celular por medio de activaciones e inhibiciones cruzadas permitirían modular de manera precisa la adaptación y supervivencia celulares frente a múltiples situaciones ambientales. A diferencia del resto de proteínas quinasas, la activación catalítica de las MAP implica la fosforilación dual en dos residuos de tirosina y treonina del motivo conservado -TXY-. Se ha empleado S. pombe como modelo para analizar la posible relevancia biológica de las formas monofosforilables de MAP quinasas Pmk1 y Sty1 (ruta de respuesta a estrés). Nuestros resultados sugieren que ambas quinasas se fosforilan mediante un mecanismo secuencial de tipo “procesivo” en el que la fosforilación en tirosina es un pre-requisito para la fosforilación en el residuo de treonina tanto en condiciones basales como en respuesta a estrés. De hecho, la imposibilidad de fosforilación de Sty1 y Pmk1 en el residuo de treonina del bucle de activación provoca la unión constitutiva entre MAPKK y MAPK, con la consiguiente hiperfosforilación en el residuo de tirosina. Las formas monofosforiladas en treonina de las MAP quinasas Sty1 y Pmk1 son funcionales in vivo, aunque de forma parcial, siendo capaces de promover una respuesta adaptativa moderada frente a estrés. Protein kinase C (PKC) family of enzymes play an essential role in the regulation of numerous physiological processes in eukaryotic organisms. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe has two PKC orthologs, Pck1 and Pck2, which act upstream of the cell integrity MAP kinase pathway (CIP) to regulate morphogenesis and cell wall biosynthesis. We found that, despite their strong structural similarity and functional redundancy, the mechanisms regulating maturation, activation and stabilization of both kinases have a remarkably distinct biological impact. Thus, in vivo phosphorylation of Pck1 within activation loop, turn and hydrophobic motifs is essential for its stability and biological functions. In contrast, Pck2 is partially functional independent of its catalytic activity. Remarkably, constitutive activation promotes dephosphorylation and destabilization of Pck2, while it enhanced Pck1 levels, which interferes with proper downstream signalling to the CIP triggered by Pck2. These results suggest that early duplication from a common ancestor involved significant changes in the mechanisms regulating catalytic activation and stability of the PKC family members, which would allow a flexible control of their biological functions, including MAP kinase signalling. TOR plays a key role in controlling cell growth and aging, and its dysfunction causes diseases such as cancer, obesity, and diabetes. We used a multidisciplinary approach combining genetic, biochemical and cell biology techniques to study the functional interactions between the CIP and TOR pathways during cell growth and in response to stress. Our results revealed that Rhy1, the GTPase activator of the TORC2 complex in S. pombe, activates the CIP by two distinct mechanisms. The first one includes the TORC2-Gad8 and TORC1-Psk1 complexes, which promote the synthesis of Pck2 in response to stress induced by cell wall damage or glucose starvation. In the second mechanism, Ryh1 activates the MAPK Pmk1 independently of TORC2, regulating the localization and/or traffic at the plasma membrane of upstream activators of the MAPK cascade including PDK-1 ortholog Ksg1 and GEF Rgf1. Finally, activated Pmk1 acts upstream of Ryh1 to inhibit TORC2 signalling in response to stress. Coordinated regulation of TOR and CIP pathways through cross-activation and inhibitory mechanisms would allow to accurately modulate cell adaptation and survival against different environmental insults. Unlike the other protein kinases, catalytic activation of the MAPKs depends on dual phosphorylation at two tyrosine and threonine residues within the conserved -TXY- motif. We have employed S. pombe as a model organism to analyze the possible biological relevance of monophosphorylated forms of MAP kinases Pmk1 and Sty1 (stress response pathway). Our results suggest that both kinases are phosphorylated by a "processive" sequential mechanism in which tyrosine phosphorylation is a pre-requisite to further phosphorylation at the threonine residue during growth and stress. In fact, the inability of phosphorylation of both Sty1 and Pmk1 at the threonine residue within the activation loop elicited the constitutive binding between MAPKK and MAPK and subsequent hyperphosphorylation at the tyrosine residue. Threonine monophosphorylated forms of the MAP kinases Sty1 and Pmk1 are partially functional in vivo and promote a moderate adaptive response to stress.