Interactions between the genetic diversity and the prevalence of pathogens in populations of Apis mellifera iberiensis

Abstract

La abeja de la miel Apis mellifera Linneo 1758 es la especie de insecto más apreciada en el mundo por los productos de la colmena que proporciona (miel, cera, polen, propóleos, etc.), y por ser la principal especie polinizadora de cultivos y flora silvestre. Debido a ello, el incremento de la mortalidad de colonias manejadas en numerosas regiones de Europa y de América ha generado una gran alarma al nivel económico, social y ambiental. Entre las variables más importantes que se han relacionado hasta la fecha con dicha mortalidad se encuentra la presencia combinada de distintos patógenos de A. mellifera en las colmenas. Entre ellos destacan por su capacidad para colapsar las colmenas el ácaro Varroa destructor; algunos virus trasmitidos por este ácaro, siendo el virus de las alas deformadas (DWV) uno de los más significativos; y los microsporidios Nosema apis y Nosema ceranae. En la lucha contra las distintas enfermedades que afectan actualmente a la abeja melífera, los estudios encaminados a la mejor comprensión de las interacciones entre huésped y hospedador son de gran relevancia. En ese sentido, la península Ibérica ofrece un interesante escenario para el estudio de estas relaciones, debido entre otros factores, a la presencia de dos linajes evolutivos de Apis mellifera iberiensis y a la notable diversidad genética de sus poblaciones. El objetivo principal de esta tesis es estudiar las interacciones entre la diversidad genética y la prevalencia de patógenos en colonias de A. m. iberiensis en España. Para ello, la tesis se ha dividido en dos partes con dos capítulos cada una. En la primera parte, se ha realizado un análisis temporal de la diversidad genética y la prevalencia de patógenos en colonias seleccionadas aleatoriamente en dos muestreos realizados a escala nacional en 2006 (113 colonias) y 2010 (115 colonias). El objetivo del primer capítulo es el de examinar la relación entre los dos linajes evolutivos mitocondriales (A: africano y M: europeo occidental) presentes en la abeja ibérica y la distribución de los patógenos V. destructor, N. ceranae y N. apis. Posteriormente, en el segundo capítulo se evalúa, a partir de marcadores de microsatélites, el impacto potencial de la rápida propagación de estos patógenos sobre la diversidad genética de la cabaña apícola nacional. La segunda parte de la tesis está enfocada al estudio del impacto del manejo apícola en la diversidad genética y la dispersión de patógenos en colonias de A. m. iberiensis. En el capítulo tres, se analiza el efecto de las prácticas apícolas migratorias sobre la dispersión del hongo Ascosphaera apis en colonias sometidas a movimientos regionales a pequeña escala. Por último, en el cuarto capítulo de esta tesis se evalúa, a una escala peninsular, el efecto de la apicultura migratoria sobre la diversidad genética y la prevalencia de parásitos y patógenos (V. destructor, Nosema spp y DWV) en colonias de abejas ibéricas. En el presente trabajo se han usado marcadores moleculares ampliamente utilizados en estudios de genética de poblacionales. En concreto, los haplotipos mitocondriales de los linajes evolutivos presentes en las colonias analizadas se han determinado mediante el análisis de la región intergénica comprendida entre el ARN transferente de la leucina (ARNtleu) y la subunidad II del gen citocromo oxidasa (cox2). Los marcadores microsatélites se han utilizado para el análisis temporal de la estructura y diversidad genética de las poblaciones de A. m. iberiensis. Con estos mismos marcadores se ha estudiado la diversidad genética intra-colonia, y se han determinado las patrilíneas, el pillaje y el reemplazo de reinas en las colonias; también se ha estudiado el efecto de la selección en los grupos de abejas. La detección de los distintos patógenos de las abejas se ha realizado de forma visual en el caso de V. destructor, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el caso de los microsporidios del género Nosema y el hongo A. apis, y mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) en el caso del DWV. Los datos obtenidos han sido tratados con programas estadísticos y genéticos (Mega, Genemapper, Microchecker, GenAlex, Genepop, Arlequín, Fstat, Adegenet, Structure, Lositan, Bayescan, Colony, HP-Rare, PGDSpider, Past 3, SPSS, etc.). Los resultados de la primera parte de la tesis, muestran una mayor prevalencia de la especie N. apis en las colonias pertenecientes al linaje evolutivo M, distribuido por el tercio norte peninsular. Se discute si esta tendencia refleja una co-evolución huésped-hospedador, o más bien una adaptación de ambos al clima más frío y húmedo del norte de España. Este patrón detectado en 2006, se ve modificado en 2010 por el incremento de la prevalencia de N. ceranae frente a N. apis. La rápida dispersión de este patógeno y el hecho de que no se detecte ninguna relación con el linaje del hospedador, sugiere un exitoso proceso de colonización y una reducida adaptación de A. mellifera. A pesar este incremento de patógenos, los niveles de diversidad genética de las poblaciones de abeja ibérica en España permanecen estables, aunque se observan diferencias significativas en las frecuencias de ciertos alelos en colonias con y sin Varroa y/o Nosema. El análisis pormenorizado de esta segregación alélica, reveló dos outlier loci relacionados con genes implicados en la respuesta inmune de las abejas. Los resultados de la segunda parte de la tesis confirman la influencia de las prácticas migratorias en la dispersión del hongo A. apis, incluso cuando los movimientos se realizan a una escala geográfica reducida. Esta influencia se confirma también a una escala peninsular para el caso de V. destructor y N. ceranae, aunque no de DWV. Respecto a la diversidad genética de las colonias, se observa un débil impacto de la apicultura migratoria, sugiriendo un posible efecto de otros factores de estrés distintos a los movimientos migratorios sobre la diversidad genética individual de las colonias. Todos estos resultados destacan la necesidad de encontrar un equilibrio entre los beneficios económicos de las prácticas migratorias y el impacto de éstas en la incidencia de enfermedades en las colmenas, con el fin de conseguir realizar una apicultura sostenible. The honey bee Apis mellifera Linnaeus 1758 is the most valuable insect species in the world, due to the beehive products it provides (honey, wax, pollen, propolis, etc.), and its role as the main pollinator of crops and wild flora. As a result, the increased losses of managed colonies in many regions of Europe and America has generated a great alarm at the economic, social and environmental levels. To date, one of the most important variables that has been related to this mortality is the combined presence of different pathogens in the A. mellifera colonies. Among them, are notable for their ability to collapse the colonies, the mite Varroa destructor; some viruses transmitted by this mite, being the deformed wings virus (DWV) one of the most significant; and the microsporidia Nosema apis and Nosema ceranae. In the fight against the several diseases that currently affect honey bees, studies aimed at better understanding the interactions between pathogens and hosts, are of great importance. In that sense, the Iberian Peninsula offers an interesting scenario for the study of these relationships, due to the presence of two evolutionary lineages in the endemic subspecies Apis mellifera iberiensis and the remarkable genetic diversity of their populations. The main objective of this thesis is to study the interactions between the genetic diversity and the prevalence of pathogens in colonies of A. m. iberiensis in Spain. This thesis has been divided into two parts with two chapters each. In the first part, a temporal analysis of the genetic diversity and the prevalence of pathogens was carried out in randomly selected colonies from two national surveys performed in 2006 (113 colonies) and 2010 (115 colonies). The objective of the first chapter is to examine the relationship between the two evolutionary mitochondrial lineages (A: African and M: Western European) present in the Iberian honey bee and the prevalence of the pathogens V. destructor, N. ceranae and N. apis. Subsequently, the potential impact of the rapid spread of these pathogens on the genetic diversity of the national beehive population is evaluated in the second chapter, by using microsatellite markers. The second part of the thesis is focused on the study of the impact of the beekeeping management on the genetic diversity and the dispersion of pathogens in colonies of A. m. iberiensis. In chapter three, the effect of migratory practices on the dispersion of the fungus Ascosphaera apis in colonies subjected to small-scale regional movements is analyzed. Finally, the fourth chapter of this thesis evaluates, at a peninsular scale, the effects of migratory beekeeping on the genetic diversity and the prevalence of parasites and pathogens (V. destructor, Nosema spp and DWV) in Iberian colonies. In the present work, molecular markers widely used in population genetic studies have been utilized. In particular, mitochondrial haplotypes of the evolutionary lineages present in the analyzed colonies have been determined by the analysis of the intergenic region between the leucine transferring RNA (tRNAleu) and the subunit II of the gene cytochrome oxidase (cox2). Microsatellite markers have been used for the temporal analysis of the structure and genetic diversity of A. m. iberiensis populations. These markers have been also used to study the intra-colony genetic diversity, and to determine the patrilines composition, drifter rates and queen replacement events in the colonies. Additionally, the influence of selection forces on the different honey bee groups has also been evaluated. The detection of the different pathogens of the honey bees was carried out visually in the case of V. destructor, by using the polymerase chain reaction (PCR) in the case of microsporidia of the genus Nosema and the fungus A. apis, and by reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) in the case of DWV. Statistical and genetic programs have been employed for the treatment of the obtained data (Mega, Genemapper, Microchecker, GenAlex, Genepop, Arlequín, Fstat, Adegenet, Structure, Lositan, Bayescan, Colony, HP-Rare, PGDSpider, Past 3, SPSS, etc). The results of the first part of the thesis show a higher prevalence of the N. apis species in colonies belonging to the M evolutionary lineage, mainly distributed in North Spain. It is discussed whether this trend reflects a host-pathogen co-evolution, or rather an adaptation of both to the colder and wetter climate of northern Spain. This pattern detected in 2006, is modified in 2010 by the increased prevalence of N. ceranae compared to N. apis. The rapid dispersion of this pathogen and the lack of relationship with the host lineage suggests a successful colonization process of N. ceranae and a reduced adaptation of A. mellifera. Despite this increase in pathogens prevalence, genetic diversity levels of Iberian bee populations in Spain remain stable. Nonetheless, significant differences in certain allele frequencies have been detected between colonies with and without Varroa and/or Nosema. The detailed analysis of this allelic segregation revealed two outlier loci related to genes involved in the immune response of bees. The results of the second part of the thesis confirm the influence of migratory practices on the dispersion of the fungus A. apis, even when movements are carried out at a reduced geographic scale. This influence is also confirmed at a peninsular scale for V. destructor and N. ceranae, but not for DWV. Regarding the genetic diversity of the colonies, there is a weak impact of migratory beekeeping, what suggests a possible effect of stress factors other than migratory movements on the genetic diversity of the individual colonies. All these results highlight the need to find a balance between the economic benefits of migratory practices and their impact on the incidence of diseases in the hives, in order to achieve a sustainable beekeeping.