Papel del óxido nítrico en la evolución del parkinsonismo y en las discinesias causadas por L-Dopa en ratas y en primates no humanos.

Abstract

El objetivo general de esta tesis es investigar la interacción entre el sistema nitrérgico y dopaminérgico en modelos experimentales de parkinsonismo en ratas y en primates no huamnos (M. fascicularis). Los objetivos específicos son: 1) Observar si el tratamiento sub-crónico con un inhibidor específico de la nNOS (7-NI) influye en la lesión de la vía nigroestriatal causada por la microinyección de la neurotoxina 6-OHDA en el estriado dorsal en ratas, 2) Verificar si existe algún efecto de la inhibición específica de nNOS en los monos que serán intoxicados con MPTP por vía intravenosa (i.v.) y en los cuales se inducirán discinesias mediante el tratamiento crónico con L-DOPA, 3) Estudiar si existe algún efecto del tratamiento dopaminérgico con L-DOPA sobre la inervación simpática cardíaca en los monos parkinsonizados con MPTP y 4) Estudiar el post-mortem de los monos para ver los mecanismos moleculares que puedan mejorar las discinesias a nivel intraestriatal. La metodología que se ha utilizado en esta tesis incluye una serie de diferentes técnicas experimentales. El tipo de técnicas utilizadas son múltiples y bien ejecutadas y comprenden: a) Una lesión estereotáxica en ratas por una inyección vía intraestriatal de 6-OHDA, con y sin tratamiento del 7-NI; b) inducción del parkinsonismo crónico experimental en macacos por inyecciones de MPTP, con o sin tratamiento terapéutico de levodopa y 7-NI; c) test de comportamiento apropiados con el fin de evaluar el número de rotaciones después del tratamiento de apomorfina en ratas lesionadas y el grado de parkinsonismo y discinesias en monos intoxicados con MPTP y d) Western Blot en tejido de corazón de los monos para cuantificar los niveles de las diferentes proteínas examinadas en el estudio.

Los principales resultados obtenidos en esta tesis demuestran que: En ratas lesionadas con 6-OHDA: a) la denervación dopaminérgica unilateral induce un aumento en los niveles de nNOS; b) la administración de un inhibidor específico, el 7-NI, protege la ruta nigroestriatal y revierte el comportamiento parkinsoniano y c) esto se consigue mediante la reducción de los niveles de DARPP-32 fosforilada y el aumento de DARPP-32 total, que son modulados de manera inversa por el tratamiento con 6-OHDA. En los monos intoxicados con MPTP y tratados con Levodopa: i) El 7-NI disminuye la gravedad (intensidad y duración) de las discinesias en monos tratados crónicamente con levodopa, apenas alterando la actividad anti-parkinsoniana de la levodopa; ii) en el tejido cardíaco, el tratamiento con MPTP disminuye los niveles de catecolaminas y aumenta la expresión de la fosfo-TH-40, que puede resultar tóxico para las células cardíacas y c) el tratamiento crónico con levodopa revierte el resultado del parkinsonismo, posiblemente induciendo un efecto cardioprotector mediante el aumento de la forma fosforilada de la proteína Hsp-27.

Palabras clave: 6-OHDA, MPTP, Óxido Nítrico, 7-NI, discinesias, L-DOPA y denervación simpática cardíaca.

SUMMARY OF PhD THESIS The general aim of the Doctoral thesis is to investigate the interaction between the dopaminergic and nitrergic system models induced experimental parkinsonism in rats lesioned with 6-OHDA and MPTP intoxicated monkeys (M. fascicularis). The specific objectives in this PhD thesis are: 1) Observe sub-chronic treatment with a specific inhibitor of nNOS (7-NI) influences in the nigrostriatal pathway injury caused by microinjection of the neurotoxin 6-OHDA in the dorsal striatum in rats, 2 ) check if there is any effect of specific inhibition of nNOS in the monkeys to be subjected to intoxication with MPTP intravenously (i.v.) and which induce dyskinesias by chronic treatment with L-DOPA, 3) Study whether there is any effect of treatment with L-DOPA on sympathetic heart innervation in MPTP-treated monkeys and 4) post-mortem study in monkeys to see the molecular mechanisms that may improve dyskinesias at intrastriatal level. The methodology used in this thesis includes a number of different experimental techniques. The type of techniques used are multiple and well executed. They included: a) stereotactic lesion in the rat by intrastriatal injection of 6-OHDA, with and without treatment of 7-NI; b) induction of experimental Parkinsonism in macaques by MPTP injections, with or without therapeutic treatment of levodopa and 7-NI; c) appropriate behavioral tests in order to evaluate the number of rotations after apomorfine treatment in lesioned rats and the degree of parkinsonism and dyskinesia in monkeys and d) Western blots on heart tissue extracts to quantify levels of the different proteins examined in the study. Main results obtained demonstrate that: in 6-ODHA lesioned rats: a) unilateral dopaninergic denervation induces an increase in the levels of nNOS; b) the administration of a specific inhibitor, the 7-NI, protects nigrostriatal pathway and reverses the parkinsonian behavior and c) this is achieved by reducing the levels of phosphorylated DARPP-32 and increasing those of total DARPP-32, which are inversely modulated by the 6-OHDA treatment. In MPTP-intoxicated and levodopa-treated-monkeys: i) 7-NI decreases the severity (both intensity and duration) of dyskinesias in chronic levodopa treated-monkeys, leaving unaffected the anti-parkinsonian activity of levodopa; ii) in the cardiac tissue, MPTP treatment decreases catecholamine levels and increases the expression of phospho-TH-40, which may result toxic for cardiac cells and iii) chronic levodopa treatment reverts parkinsonian outcome, possibly inducing a cardio-protective effect by increasing the phosphorylated form of Hsp-27.