Caracterización de la estructura y función de la rabfilina 3A

Abstract

En el desarrollo de esta Tesis Doctoral se han caracterizado estructural y funcionalmente los dominios C2 de la Rabfilina 3A. Esta proteína contiene dos dominios C2, C2A y C2B dispuestos en tándem y existen evidencias de su participación en el proceso de exocitosis y fusión vesicular a través de su capacidad de interaccionar con el complejo SNARE. Esta proteína controla el proceso de recaptación de nuevas vesículas, siendo la interacción con el SNAP25 un paso regulador clave. Los estudios bioquímicos y biofísicos han demostrado que cada uno de los dominios C2 presentan un modo diferente de unión a calcio, así como diferentes afinidades por los fosfoinosítidos, lo que podría implicar una diferencia en la regulación de la transmisión sináptica y los procesos de secreción de vesículas. El comportamiento en tándem de los dominios C2AB de rabfilina 3A presenta un comportamiento característico que se ha estudiado mediante técnicas biofísicas, bioquímicas y de biología molecular. Mediante el estudio de la proteína silvestre y el desarrollo de construcciones mutantes se ha caracterizado el modo de unión de esta proteína a la membrana y al complejo SNARE. Mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha determinado que el dominio C2A de rabfilina 3A se une principalmente a la membrana formadas por POPC/POPS/PI(4,5)P2 por la región rica en lisinas del dominio. El aumento de calcio en el sistema permite anclar al dominio por otra zona del mismo, la región de unión a calcio. Los puntos de unión del dominio C2B permanecen bloqueados por la disposición relativa de ambos dominios, quedando accesible la hélice H2, principal zona por la que la proteína es capaz de interaccionar con el complejo SNARE. El dominio C2AB de rabfilina 3A no es capaz de formar agregados por si sólo, pero la presencia de vesículas formadas por fosfolípidos permite que los dominios de la proteína se unan de forma dependiente de calcio a dos membranas acercando a ambas observándose un aumento en el tamaño de los agregados cuando son estudiados mediante dispersión dinámica de la luz (DLS). Con microscopía electrónica de transmisión se ha corroborado el tamaño de estos agregados visualizándose la potencial capacidad de fusión de vesículas. Mediante mutaciones se ha determinado que la zona del conector entre ambos dominios podría actuar como freno de la capacidad de agregación, porque cuando los residuos son mutados la capacidad de agregación se ve aumentada de manera significativa. Otro punto de control en la capacidad de formar agregados se encuentra en los lazos de unión a calcio del dominio C2A, actuando como punto de control positivo de la unión del dominio a la membrana. La obtención de la estructura cristalina del dominio C2B de rabfilina con SNAP25 ha permitido determinar los residuos clave en la interacción. Mediante la combinación de diferentes técnicas bioquímicas y biofísicas se ha propuesto que los dominios C2AB dispuestos en tándem son capaces de coordinar calcio y PI(4,5)P2 por la zona de unión a calcio y de la región rica en lisinas; mientras que se une al SNAP25 a través de la hélice H2 del dominio C2B. Se ha determinado que la interacción entre C2AB de rabfilina 3A y SNAP25 ocurría también con los complejos SNAP25/STX1A y SNAP25/STX1A/VAMP2. Esta unión es dependiente de calcio y precisa del dominio completo para que tenga lugar esta interacción. Con todos estos resultados se propone un modelo que trata de explicar cómo la rabfilina 3A participa en el proceso de fusión vesicular con la cooperación de calcio y PI(4,5)P2.This PhD thesis deals with both the structural and functional characterization of the C2 domains of Rabphilin 3A. This protein contains two C2 domains, C2A and C2B, located in tandem. There are some precedents that show the participation of this protein in several processes such as exocytosis or vesicle fusion due to its ability to interact with the SNARE complex. Rabphilin 3A controls the process of recaption of new vesicles, being the interaction with SNAP25 the key regulation step of the overall process. Several biochemical and biophysical studies have demonstrated that each of the C2 domains shows a different mode to bind to calcium, as well as different affinities for phosphoinositides, what could imply a difference in the regulation of the synaptic transmission and the processes related to vesicle secretion. The tandem domain C2AB has a characteristic behaviour markedly different form that of the independent C2A and C2B domains, which has been studied through biophysical, biochemical, and molecular biology techniques. The comparison of the behaviour of the wild type protein with several mutant constructs have served to characterize the binding mode of this protein to the membrane and the SNARE complex. The isothermal titration calorimetry (ITC) technique has been used to determine that the C2A domain of the Rabphilin 3A binds to the membranes formed by POPC/POPS/PI(4,5)P2 mainly through its lysine-rich cluster. The presence of calcium in the media allows the anchoring of the domain to the lipid membrane through a different region, also called the calcium-binding region. The binding areas of the C2B domain remain blocked due to the relative tandem orientation of the two domains in the C2AB structure, being accessible the H2 helix, which in turn becomes the main area able to interact with the SNARE complex. The C2AB domain of Rabphilin 3A is not able to form aggregates on its own, but the presence of vesicles containing phopholipids allows that the domains of the proteins bind to two membranes in a calcium-dependant manner, hence bringing them together and provoking the enlargement of the size of the aggregate particles. This experimental fact can easily observed by analyzing the sample with the dynamic light scattering (DLS) technique. The use of transmission electronic microscopy has corroborated the size of these aggregates, visualizing the potential ability of this protein to fuse vesicles. The generation of mutant constructs have served to determine that the linker among both domains could hamper the aggregation ability, since a mutation on the aminoacid residues of the linker provoked a significant enhancement of the binding capability. Another checkpoint of the ability to bind membrane was found in the loops of the calcium binding region of the C2A domain, acting as a positive control checkpoint of the binding of the domain to the membrane. The determination of the crystal structure of the C2B domain of Rabphilin 3A interacting with SNAP25 has allowed the identification of the key residues involved in this interaction. A combination of several biophysical and biochemical techniques have been used to propose that the tandem C2AB domains are able to coordinate calcium and PI(4,5)P2 through the calcium-binding region and the lysine rich cluster, while the binding to the SNAP25 takes place through the H2 helix of the C2B domain. In addition, it has been determined that the interaction observed of the C2AB of Rabphilin 3A and SNAP25 also occurs in the complexes SNAP25/STX1A and SNAP25/STX1A/VAMP2. This binding is calcium-dependant and needs the whole domain to happen. With all these results in mind we have proposed a model to explain how the Rabphilin 3A participates in the vesicle fusion process along with the cooperation of calcium and PI(4,5)P2.