Identificación de factores de virulencia en la mucormicosis

Abstract

La mucormicosis es una enfermedad emergente y letal causada por hongos del orden Mucorales. Esta infección está caracterizada por altas tasas de morbilidad y mortalidad, que se deben principalmente a la escasez de tratamientos clínicos. Esta enfermedad afecta principalmente a pacientes inmunocomprometidos, como aquellos con cáncer, que están siendo tratados con quimioterapia, o inmunosuprimidos para trasplante de órganos. Otros pacientes de riesgo son aquellos con diabetes, altos niveles de hierro en suero, trauma, quemaduras o neutropenia. Los hongos responsables de la mucormicosis son muy resistentes a los antifúngicos disponibles, lo que ocasiona que el tratamiento sea muy limitado. Por consiguiente, esta infección se ha convertido en una amenaza para la salud pública, de ahí la necesidad de desarrollar nuevas terapias para tratarla. Los Mucorales pertenecen a un grupo de hongos basales poco estudiado, debido principalmente a que son reacios a las técnicas moleculares clásicas. Mucor circinelloides es uno de los agentes causales de la mucormicosis y es el mejor modelo para estudiar la infección a nivel molecular. En este trabajo, se propone el uso de M. circinelloides para identificar nuevos factores de virulencia en la mucormicosis, generando nuevas herramientas que permitan caracterizar fenotipos de virulencia y analizar en detalle los mecanismos críticos de esta infección. La caracterización del mecanismo de silenciamiento génico en M. circinelloides ha permitido el diseño de una plataforma de genómica funcional basada en el RNAi para estudiar la patogénesis. Esta genoteca está formada por plásmidos que sintetizan RNA de doble cadena diana de cualquier gen del genoma del hongo. Gracias a esta herramienta, se ha obtenido una colección de transformantes silenciantes que representan todo el genoma, y que muestran fenotipos relacionados con la virulencia. En concreto, se han identificado dos genes implicados en la patogénesis de M. circinelloides: mcplD, que cifra una fosfolipasa D; y mcmyo5, que cifra una proteína transportadora de la familia Miosina V. La captación de hierro durante la mucormicosis es un factor crítico que determina el resultado de la infección. El sistema de captación de hierro más relevante durante la invasión del hospedador es el de alta afinidad, y está formado por un complejo permeasa-ferroxidasa. En este trabajo, se han identificado tres genes que cifran ferroxidasas, llamados fet3a, fet3b, y fet3c, y que forman parte de este mecanismo de alta afinidad. Esta familia de ferroxidasas se expresa tanto en condiciones bajas de hierro, como durante la infección in vivo. La combinación de mutantes simples y dobles en los tres genes reveló que fet3c es el gen más importante para la virulencia. Sin embargo, hay una redundancia funcional entre todos los miembros de la familia génica en crecimiento in vitro con bajos niveles de hierro y en la infección de ratón. Además, el gen fet3a se expresa solo durante el crecimiento como levadura, lo que sugiere una especialización funcional de los sistemas de captación de hierro en la transición dimórfica levadura-micelio. Con el objetivo de mejorar las herramientas moleculares para el estudio de la patogénesis de los Mucorales, en este trabajo se ha generado una estirpe bioluminiscente de M. circinelloides para la monitorización in vivo de la infección. Para ello, la estirpe expresa el gen de la luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor fuerte que asegura la emisión estable de luz. Se han obtenido dos estirpes bioluminiscentes que no presentan diferencias fenotípicas en la virulencia y sensibilidad a antibióticos respecto a su control silvestre. En conjunto, nuestra estrategia ha permitido la identificación de factores de virulencia en tres pasos clave: primero, el desarrollo de una plataforma de genómica funcional basada en el RNAi que permite el escrutinio de fenotipos de patogénesis; segundo, el análisis en detalle del sistema de captación de hierro durante la infección para la caracterización de tres genes de ferroxidasas; y tercero, la generación de la primera estirpe bioluminiscente de M. circinelloides que facilitará la monitorización in vivo en modelos animales vivos, dando paso a futuros estudios funcionales de patogénesis y resistencia a antifúngicos.

Mucormycosis is an emergent life-threatening infection caused by fungi of the order Mucorales. This infectious disease is characterized by high morbidity and mortality rates, mainly because of the scarcity of successful clinical treatments. This infection affects predominantly immunocompromised patients, including those with cancer, chemotherapy, or immunosuppression for organ or bone marrow transplants. Other patients at increased risk of infection are those with diabetes, iron overload syndromes, trauma, burns, or neutropenia. The fungal agents of mucormycosis are resistant to most of the antifungal drugs available; thus, clinical treatments are limited by toxicity and resistance. Overall, this emergent infection is becoming a challenge to public health, hence the need to develop new therapies to treat this disease. Mucorales are a group of understudied basal fungi, mainly because they are reluctant to classical molecular tools. Mucor circinelloides is one of the causal agents of mucormycosis and is the only model to properly study the infection at a molecular level. In this work, we propose the use of M. circinelloides to identify new virulent factors in mucormycosis, generate new tools to characterize virulent phenotypes, and deeply analyze critical mechanisms involved in the infection. The characterization of the gene silencing mechanism in M. circinelloides has allowed the design of an RNAi-based functional genomics platform to study virulence processes. This library consists of high-throughput plasmids that synthesize double-stranded RNAs targeting any possible gene in the fungal genome. Thanks to this new genetic tool, we obtained a collection of silenced transformants that represented the whole genome, showing a broad variety of phenotypes related to virulence processes. Using this platform, two genes involved in M. circinelloides pathogenesis were identified: mcplD, which encodes a Phospholipase D; and mcmyo5, encoding a cargo transporter of the Myosin V family. Iron acquisition during mucormycosis is a critical factor that shapes the outcome of the infection. The high-affinity system is the most important iron uptake mechanism during the host invasion and consists of a permease-ferroxidase complex. In this work, three genes coding for ferroxidases, named fet3a, fet3b, and fet3c, have been identified as part of this high-affinity iron uptake mechanism. This family of ferroxidases is expressed both under iron-depleted conditions and during in vivo infection in a mouse model. A combination of single and double mutants of the three genes revealed that fet3c is the most important for virulence, although there is a functional redundancy among the members of the gene family during both in vitro growth with low iron and mouse infection. Also, fet3a is only expressed during yeast growth, suggesting a functional specialization of the high-affinity iron uptake mechanism in the dimorphic yeast-mycelium transition. Aiming at the improvement of the molecular tools to study Mucorales pathogenesis, this work produced a reporter strain of M. circinelloides for in vivo monitoring of the infection. For the first time, we generated a strain expressing the firefly luciferase driven by a strong promoter that ensured a stable light emission. The two reporter strains obtained had no phenotypical differences in virulence and antifungal sensitivity compared to the wild-type control. Altogether, our strategy to identify virulence factors followed three key steps: first, the development of an RNAi-based functional genomics platform that allows the screening of phenotypes related to pathogenesis; second, the deep analysis of the iron uptake mechanism during the infection using M. circinelloides as a model for the genetic characterization of three ferroxidases genes; and third, the generation of the first bioluminescent reporter strain in M. circinelloides that facilitates in vivo monitorization of the infection in live animal models, allowing future functional studies related to pathogenesis and drug susceptibility.