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    Disfunción endotelial en hipertensión gestacional inducida por inhibición de la catecol-O-metiltransferasa
    (2015-04-30) Hernández García, Moisés; Hernández García, Isabel; Fenoy Palacios, Francisco José; Facultad de Medicina
    El presente trabajo de Tesis Doctoral evaluó si la inhibición de la catecol-O-metiltransferasa en ratas gestantes conduce a un incremento de la presión arterial y a una disfunción endotelial como consecuencia de una disminución en la biodisponibilidad de óxido nítrico. Objetivos: las metas que persigue este trabajo son 1) comprobar el efecto in vivo sobre el tono vascular del 2-metoxiestraidol y la participación del óxido nítrico en tal efecto, 2) desarrollar un modelo de hipertensión gestacional en rata mediante la inhibición farmacológica de la actividad catecol-O-metiltransferasa, 3) estudiar la repercusión de la baja actividad catecol-O-metiltransferasa sobre la función endotelial en ratas gestantes mediante el análisis de la función endotelial en vasos de conductancia y resistencia y determinar las diferencias en la liberación estimulada de óxido nítrico desde el endotelio vascular y 4) estudiar el papel del anión superóxido en la disfunción endotelial y reducción de la biodisponibilidad de óxido nítrico observada en nuestro modelo de ratas gestantes con inhibición de la actividad catecol-O-metiltransferasa. Metodología: el efecto vasodilatador del 2-ME se estudió en arteriolas del lecho mesentérico mediante determinación del flujo sanguíneo tisular y en arteriolas del lecho pial mediante la obtención de imágenes tras la instalación de una ventana craneal cerrada. Un inhibidor de la catecol-O-metiltransferasa (entacapona) fue suministrado a ratas gestantes Sprague-Dawley por gavage entre el día 10 y 20 de gestación. La presión arterial se midió por pletismografía en la arteria de la cola. La relajación dependiente de endotelio en vasos de conductancia se evaluó midiendo la contracción de anillos aórticos con un transductor de fuerza isométrica. La relajación dependiente de endotelio en vasos de resistencia se evaluó en pequeñas arterias mesentéricas. La liberación endotelial de óxido nítrico se evaluó en tiras aórticas por amperometría de pulso diferencial. Para valorar el papel del estrés oxidativo, la función endotelial vascular y la liberación de óxido nítrico se evaluó tanto en presencia como en ausencia de tempol. Resultados: la superfusión del lecho mesentérico con concentraciones crecientes de 2-ME (0.1-100 µM) condujo a un incremento significativo de la señal de flujo mesentérico medido por laser-Dopler. La superfusión con concentraciones crecientes de 2-ME de la superficie pial con la técnica de la ventana craneal cerrada condujo a una vasodilatación de las arteriolas piales. La presión arterial de ratas gestantes tratadas con entacapona se incrementó significativamente comparándola con la de ratas gestantes no tratadas en los días 14 y 19 de gestación. Tanto los vasos de conductancia (anillos aórticos) como los de resistencia (pequeñas arterias mesentéricas) procedentes de ratas gestantes tratadas con entacapona mostraron una menor relajación en respuesta a acetilcolina comparados con los vasos procedentes de ratas tratadas con vehículo y ratas vírgenes. En arteriolas mesentéricas, esta disfunción endotelial fue abolida en presencia de L-NAME, indicando que se debe a una reducción en la biodisponibilidad de óxido nítrico; también mejoró en presencia de tempol, sugiriendo un incremento de estrés oxidativo en ratas gestantes hipertensas. La liberación endotelial de óxido nítrico inducida por un ionóforo del calcio (A23187) fue significativamente mayor en tiras de aorta procedentes de ratas preñadas tratadas con vehículo comparadas con ratas gestantes tratadas con entacapona. Así mismo, esta disfunción endotelial se previno por la adición de tempol. Este estudio muestra que la inhibición de la catecol-O-metiltransferasa en ratas gestantes conduce a una hipertensión arterial y disfunción endotelial debido a una biodisponibilidad de óxido nítrico reducida. Summary: The present Doctoral Thesis evaluated whether catechol-O-methyltransferase inhibition in pregnant rats results in increased blood pressure and vascular endothelial dysfunction as a consequence of decreased nitric oxide bioavailability. Objetives: the goals this work pursued were 1) check the in vivo effect on vascular tone of 2-ME and the participation of nitric oxide in this effect, 2) develop a model of gestational hypertension in rats by pharmacological inhibition of catechol-O-methyltransferase activity, 3) study the impact of low catechol-O-methyltransferase activity on endothelial function in pregnant rats by assessing endothelial function in conductance and resistance vessels and determine differences in stimulated release of nitric oxide from the vascular endothelium and 4) study the role of superoxide in the endothelial dysfunction and reduced nitric oxide bioavailability observed in our model of pregnant rats with inhibition of catechol-O-methyltransferase activity. Methods: the vasodilatory effect of 2-ME was evaluated in mesenteric arterioles by determining tissue blood flow and in pial arterioles by the obtaining of images after the installation of a closed cranial window. Pregnant Sprague-Dawley rats were given entacapone (a catechol-O-methyltransferase inhibitor) by gavage from the 10th to the 20th day of pregnancy. Blood pressure was measured by plethysmography in the tail artery. Endothelium-dependent relaxation of conductance vessels was assessed by measuring the contraction of aortic rings with an isometric force transducer. Endothelium-dependent relaxation of resistance vessels was assessed in pressurized mesenteric small arterial vessels. Endothelial NO release was measured in aortic strips by differential normal pulse amperometry. In order to study the role of oxidative stress, vascular endothelial function and NO release were assessed both in the absence and in the presence of tempol. Results: mesenteric bed superfusion with increasing concentrations of 2-ME (0.1 to 100 µM) increased mesenteric blood flow signal measured by laser-Doppler. Increasing concentrations of 2-ME superfusion on the pial surface through the technique of the closed cranial window led to a pial arteriole vasodilation. Systolic blood pressure increased significantly in pregnant rats treated with entacapone compared with untreated pregnant rats on days 14 and 19 of gestation. Both conductance (aortic rings) and resistance vessels (mesenteric small arteries) from entacapone-treated pregnant rats showed diminished relaxation in response to acetylcholine compared with vessels from vehicle-treated pregnant and virgin rats. In mesenteric arterioles, this endothelial dysfunction was abolished in the presence of l-NAME, indicating that it was caused by reduced NO availability, and it also improved in the presence of tempol, suggesting increased oxidative stress in hypertensive pregnant rats. Endothelial release of nitric oxide induced by calcium ionophore (A23187) was significantly greater in aortas from vehicle-treated pregnant rats than in aortas from pregnant rats given entacapone. This endothelial dysfunction seen in hypertensive rats was prevented by addition of tempol. The present study provides evidence that catechol-O-methyltransferase inhibition in pregnant rats produces arterial hypertension and endothelial dysfunction due to reduced nitric oxide bioavailability.
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    Efecto de los flavonoides sobre la función endotelial en ratas con hipertensión arterial
    (2015-09-03) Paredes Carreras, María Dolores; García-Estañ López, Joaquín; Ortiz Ruiz, María Clara; Castillo Sánchez, Julián; Facultad de Medicina
    Introducción De acuerdo con las estadísticas de la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades cardiovasculares constituyen la principal causa de muerte en los países desarrollados, siendo la hipertensión arterial (HTA) su principal factor de riesgo confirmando, por tanto, que sigue siendo un problema mundial de salud pública. Durante las últimas décadas, se han logrado avances significativos en el tratamiento de la hipertensión mediante el uso de inhibidores del sistema renina-angiotensina (SRAA), ya sea con inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECAs), antagonistas de los receptores de angiotensina II de tipo 1 (ARA II), diuréticos, betabloqueantes o bloqueantes de los canales de calcio. Un número creciente de estudios epidemiológicos observacionales han examinado la asociación entre la ingesta de alimentos ricos en polifenoles y flavonoides, con el desarrollo y evolución de ciertas enfermedades crónicas. En general, la evidencia epidemiológica muestra que una mayor ingesta de flavonoides se asocia con un menor riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares. El creciente interés en la búsqueda de soluciones farmacológicas eficaces y carentes de efectos secundarios significativos, y su potencial papel en la regulación de la función cardiovascular, ha supuesto en los últimos años un incremento en los estudios de aplicación de estos compuestos, incidiendo en la necesidad de establecer asimismo sus vías y mecanismos de actuación, tanto molecular como fisiológicamente. Objetivos El objetivo principal de esta Tesis ha sido evaluar el efecto de distintos grupos de flavonoides en el tratamiento de la HTA experimental. Además, se han estudiado algunos de los mecanismos potencialmente responsables de este efecto, intentando, al mismo tiempo, establecer una relación estructura-actividad para los diferentes flavonoides estudiados. Metodología Se realizó un estudio metabólico de 24 horas para medir la diuresis, natriuresis y balance de sodio y obtener muestras de orina. Posteriormente, se realizaron medidas de la presión arterial media (PAM), se obtuvieron muestras de plasma y riñón, y se aisló la aorta torácica para evaluar la respuesta a acetilcolina (ACh) dependiente de endotelio. Para estimar los niveles de óxido nítrico (NO), se determinó la excreción urinaria de nitritos y, como biomarcador del estrés oxidativo, se midieron las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) en riñón, orina y plasma. Para ello, se han utilizado dos modelos de HTA experimental: a) Hipertensión arterial por déficit de óxido nítrico o modelo de hipertensión L-NAME b) Hipertensión arterial espontánea (SHR) Resultados Los ensayos y experimentos de este trabajo, muestran que los extractos de flavonoides empleados, reducen significativamente la presión arterial media (PAM) y mejoran la mayoría de los parámetros fisiológicos estudiados, siendo sus estructuras esenciales para esta mejora. Conclusiones Resulta evidente, que existe una relación directa entre la estructura molecular de estos flavonoides y su actividad biológica específica en cada uno de los parámetros evaluados en la presente memoria. Palabras clave: Hipertensión arterial (HTA); inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA); óxido nítrico (NO); relajación dependiente de endotelio; reactividad vascular; estrés oxidativo (EO); Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME); rata espontáneamente hipertensa (SHR); presión arterial (PA); flavonoides. Introduction According to statistics from the World Health Organization (WHO), cardiovascular diseases are the major cause of death in developed countries, the arterial hypertension (HTA) is the main risk factor confirming therefore, remains a global public health problem. During the last decades, significant progress in the treatment of hypertension has been made through the use of inhibitors of the renin-angiotensin system; with either angiotensin-converting enzyme inhibitors or angiotensin receptor type 1 blockers, diuretics, beta-blockers, and calcium channel blockers. A growing number of observational epidemiological studies have examined the association between the intake of foods rich in polyphenols and flavonoids, with the development and evolution of certain chronic diseases. Overall, the epidemiological evidence generally shows that a higher flavonoid intake is associated with lower cardiovascular disease. The increasing interest in the search for effective and safe pharmacological solutions lacking of significant side effects and potential role in the regulation of cardiovascular function, has lead in recent years to an increase in the studies of these compounds, stressing the need to further establish their pathways and mechanisms of action, both molecular and physiologically. Objectives The main objective of this thesis was to evaluate the effect of different groups of flavonoids in the treatment of experimental hypertension. In addition, we have studied some potential mechanisms responsible for this effect, trying at the same time, establish a structure-activity relationship for the different flavonoids studied. Methodology A metabolic study of 24 hours was performed to measure the diuresis, natriuresis and sodium balance and obtain urine samples. Then, we measured mean arterial pressure (MAP), heart, kidney and plasma samples were obtained by isolating the thoracic aorta to evaluate the response to acetylcholine (ACh) endothelium dependent. To estimate the levels of nitric oxide (NO), nitrite urinary excretion was determined and as a biomarker of oxidative stress, we measured the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) in kidney, urine and plasma. We used two experimental models of experimental hypertension: a) N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) induced hypertension rats b) Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) Results Tests and experiments of this work show that the flavonoid extracts used, significantly reduce mean arterial pressure (PAM) and improve most physiological parameters studied being their structures critical for this improvement. Conclusions It seems evident, as main conclusion, that there is a direct relationship between the molecular structure of these flavonoids and their specific biological activity in each of the parameters evaluated herein. Key words: Arterial hypertension (HTA); inhibitors of the renin-angiotensin system (IECA); nitric oxide (NO); endothelium-dependent relaxation; vascular reactivity; oxidative stress; Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME); spontaneously hypertensive rats (SHR); blood pressure (BP); flavonoids.
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    Estudio comparativo del efecto de las soluciones equiosmolares de manitol 20% versus salino hipertónico 3% sobre la hemostasia sanguínea evaluado mediante tromboelastometría rotacional durante cirugía intracraneal electiva
    (2014-07-28) Fuentes García, Diego; Hernández Palazón, Joaquín; Falcón Araña, Luis; Acosta Villegas, Francisco; Departamento de Cirugía, Pediatría, Obstetricia y Ginecología
    INTRODUCCIÓN: El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue comparar el efecto de las soluciones equiosmolares de manitol 20% y SSH 3% sobre la hemostasia sanguínea mediante tromboelastometría rotacional (ROTEM) y pruebas estándar de laboratorio, así como evaluar el grado de asociación entre ambas pruebas. Los objetivos secundarios fueron el estudio de la eficacia de ambas soluciones sobre la relajación encefálica y la presencia de efectos indeseables mediante el análisis de la osmolaridad plasmática, balance hidroelectrolítico y variables hemodinámicas en pacientes sometidos a cirugía intracraneal electiva por diferentes enfermedades neurológicas. MÉTODOS: Ensayo clínico prospectivo, randomizado y triple ciego. Tras la aprobación por el Comité de Ética de nuestro hospital y la obtención del consentimiento informado, fueron reclutados pacientes con estado físico ASA≤III programados para cirugía intracraneal por diversas patologías neuroquirúrgicas (tumor cerebral, aneurisma o malformación arteriovenosa). Los pacientes recibieron 3 ml/kg de manitol 20% (osmolaridad 1098 mOsm/l, n=30) o SSH 3% (osmolaridad 1026 mOsm/l, n=30) en el momento de la incisión quirúrgica. Se registraron variables ROTEM mediante análisis EXTEM, INTEM y FIBTEM (CT, CFT, ángulo alfa, MCF), hematocrito, hemoglobina, coagulación estándar (recuento plaquetario, fibrinógeno, TP, TTPa, dímero-D), osmolaridad y electrolitos en sangre arterial y orina, variables hemodinámicas (IC, VVS, IRVS, IVS; presión arterial y PVC), balance hídrico, gasometría arterial, glucosa y lactato. Las mediciones se efectuaron antes de la infusión de la solución hiperosmolar y 30, 120 y 360 min tras su infusión. El cirujano evaluó el estado de relajación encefálica en una escala de cuatro puntos (1,relajado; 2,satisfactorio; 3,tenso; 4,abultado). El estudio estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía y prueba t de Student para medidas repetidas en cada grupo, y correlación de Pearson entre variables de ROTEM y laboratorio. RESULTADOS: No se encontraron diferencias significativas en las variables demográficas entre grupos. El análisis de ROTEM no detectó diferencias entre grupos en los parámetros CT, CFT, alfa y MCF, con valores dentro de la normalidad. Las variables de laboratorio (hemoglobina, hematocrito, recuento plaquetario y pruebas estándar de coagulación) fueron similares en ambos grupos sin observar cambios significativos con respecto a la situación basal. El análisis de regresión lineal simple mostró una correlación moderada entre el MCF y el fibrinógeno, siendo débil la correlación entre CFT EXTEM y el fibrinógeno y recuento plaquetario. No se observaron diferencias en la relajación encefálica entre grupos siendo óptima en el 76 % de pacientes en el grupo manitol y en el 87% en el grupo SSH. Se evidenció un aumento similar de osmolaridad en sangre con los dos agentes y un descenso de osmolaridad urinaria. El sodio aumentó significativamente tras la administración del SSH 3% a diferencia del grupo manitol 20% donde se observó una disminución significativa a los 30 min seguido de un aumento que fue significativo a los 360 min. La glucemia y lactato aumentaron de forma similar en ambos grupos, sin encontrar diferencias en las variables hemodinámicas. CONCLUSIONES: Las soluciones equiosmolares de manitol 20% y SSH 3% durante cirugía intracraneal electiva no producen alteraciones hemostáticas evidenciables mediante ROTEM, a diferencia de los estudios in vitro, ni mediante pruebas estándar de laboratorio. Existe una asociación moderada entre variables como MCF y el fibrinógeno o recuento plaquetario, sin correlación directa. El uso de ROTEM no sería una prueba imprescindible en el lugar de asistencia del paciente neuroquirúrgico, siempre y cuando no existan alteraciones hemostáticas o hemorragia grave perioperatorias. La administración de 3 ml/Kg de manitol 20% o de SSH 3% proporciona condiciones quirúrgicas y de relajación encefálica óptimas en estos pacientes, siendo segura su utilización en neurocirugía, ya que no evidenciaron alteraciones hemodinámicas, de osmolaridad ni electrolíticas clínicamente relevantes. ABSTRACT BACKGROUND: The main goal in this thesis was to compare the effect of equiosmolar solutions of 20% mannitol and 3% hypertonic saline (HS) on blood hemostasis by means of rotational thromboelastometry (ROTEM) and standard coagulation tests, and also to assess the association between these tests. Secondary objectives were to study the effectiveness of both solutions on brain relaxation and the presence of side effects by measuring plasma osmolarity, fluid and electrolyte balance and hemodynamic variables in patients scheduled to elective intracranial surgery for different neurological pathologies. METHODS: A prospective, randomized, triple-blinded clinical trial was performed. After IRB approval and signing of informed consent, patients with ASA physical status ≤III undergoing intracranial surgery for diverse neurosurgical pathologies (brain tumor, aneurism, arteriovenous malformation) were recruited, receiving either 3 ml/kg of 20% mannitol (osmolarity 1098 mOsm/l, n=30) or 3% HS (osmolarity 1026 mOsm/l,n=30) before surgical incision. ROTEM variables by EXTEM, INTEM and FIBTEM tests (CT, CFT, alpha angle, MCF) were analyzed along with hematocrit, hemoglobin, standard coagulation tests (platelet count, fibrinogen, PT, aPTT, D-dimer), osmolarity with electrolytes in arterial blood and urine, hemodynamic variables (CI, SVV, SVRI, SVI, blood pressure and CVP), fluid balance, arterial gasometry, glucose and lactate. Measurement points were performed before infusion of hyperosmolar solution and 30, 120 and 360 min after its infusion. Neurosurgeon assessed brain relaxation in a four point score (1, relaxed, 2, satisfactory, 3, firm, 4, swollen). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA and Student’s t-test for repeated measures in each group, with Pearson correlation test between ROTEM and laboratory variables. RESULTS: No differences were found in demographic variables between groups. ROTEM analysis showed no differences between groups relating to CT, CFT, alpha angle and MCF parameters, with values within normal. Laboratory variables (hemoglobin, hematocrit, platelet count and standard coagulation tests) were similar in both groups without significant changes related to baseline. Simple linear regression analysis evidenced a moderate correlation between MCF and fibrinogen, with a weak correlation between EXTEM CFT and fibrinogen and platelet count. There were no differences in brain relaxation between groups, even it was optimal in 76% of patients in mannitol group and in 87% in HS group. A similar increase in serum osmolarity was observed with the two agents along with a decrease in urine osmolarity. Sodium had a significant increase after 3% HS administration, in contrast to 20% mannitol which associated to a significant decrease after 30 min and a significant rise after 360 min. Glucose and lactate increased in a similar way in both groups, without differences in hemodynamic variables. CONCLUSIONS: Equiosmolar solutions of 20% mannitol and 3% HS during elective intracranial surgery do not originate any hemostatic impairment demonstrable either by ROTEM, in contrast to in-vitro studies, or standard laboratory tests. A moderate association was evidenced between variables such as MCF and fibrinogen or platelet count, without a direct correlation. Use of ROTEM is not an essential “point-of-care” test for neurosurgical patients, whenever no hemostatic impairment or severe perioperative hemorrhage are proved. Administration of 3 ml/kg of 20% mannitol or 3% HS provides optimal surgical and brain relaxation conditions in these patients, and its use is safe in neurosurgery as no hemodynamic, osmolarity or electrolyte impairment were clinically relevant.
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    Factor V Leiden y enfermedad cerebrovascular / Juan Antonio Iniesta Valera ; directores Vicente Vicente García, Javier Corral de la Calle.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Medicina Interna,, 1996) Iniesta Valera, Juan Antonio