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Browsing by Subject "Teleósteos"

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Caracterizació molecular y funcional de Gbp4 de pez cebra : un nuevo componente del inflamasoma= Molecular and functional chraterization of zebrafish Gbp4: a new inflammasome component
(2015-09-08) Tyrkalska, Sylwia Dominika; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
INTRODUCCIÓN: La señalización a través de los NOD-like receptors (NLRs), que son una familia de receptores citosólicos de reconocimiento de patrones (PRRs), da lugar al procesamiento y activación de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1 β e IL-18 mediados por caspasa-1, así como de la inducción de una forma de muerte celular recientemente descrita llamada piroptosis. Para ello, los NLRs median la formación de plataformas multiproteicas de señalización llamadas inflamasomas, que alertan al sistema inmune de la presencia de infección o daño tisular. OBJETIVOS: (1) Establecimiento de un modelo de infección de Salmonella Typhimurium en pez cebra para estudiar la activación, el ensamblaje y el funcionamiento del inflamasoma; (2) Caracterización del papel de la flagelina de S. Typhimurium en el mecanismo de infección en pez cebra; (3) Caracterización del papel de Gbp4 de pez cebra en la activación y ensamblaje del inflamasoma, así como en la eliminación de S. Typhimurium; (4) Caracterización del papel de los neutrófilos en la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 en pez cebra; (5) Caracterización del papel de Gbp4 en la producción de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, y del de las prostaglandinas en la eliminación de S. Typhimurium. METODOLOGÍA: Los métodos utilizados en la tesis doctoral son: Ensayos de infección con S. Typhimurium, ensayos de actividad caspasa-1, toma de imágenes de larvas de pez cebra, reclutamiento de neutrófilos y análisis de la muerte celular, ensayos de luminescencia, citometría de flujo, análisis de expresión génica, Western blot, ensayo de reconstitución del inflamasoma en células HEK293. RESULTADOS: Aquí demostramos que la proteína Gbp4 de pez cebra, una enzima GTPasa inducible por IFNγ que alberga un dominio C-terminal CARD, se expresa en los neutrófilos y es necesaria para la eliminación de Salmonella Typhimurium in vivo dependiente del inflamasoma. A pesar de la presencia del dominio CARD, Gbp4 requiere la presencia de la proteína adaptadora Asc para desempeñar su función antibacteriana. Además, la actividad GTPasa de Gbp4 es indispensable para la activación del inflamasoma, el reclutamiento de neutrófilos al lugar de la infección, y la eliminación de S. Typhimurium. La reconstitución de los complejos Gbp4-Asc en células embrionarias humanas de riñón (HEK293) en cultivo, nos mostró que forman complejos macromoleculares con un anillo exterior de Asc y un núcleo de Gbp4. Mecanísticamente, Gbp4 es esencial para la liberación de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, de las cuales PGD2 se asocia con la eliminación de bacterias mediada por Gbp4. Por tanto, nuestros resultados señalan a las proteínas de unión con GTPasa como los adaptadores clave del inflamasoma necesarios para la biosíntesis de prostaglandinas y la eliminación de bacterias intracelulares por los neutrófilos in vivo. CONCLUSIONES: (1) El pez cebra es un excelente modelo para estudiar la activación y la función del inflamasoma en respuesta a una infección por S. Typhimurium; (2) El reconocimiento intracelular de S. Typhimurium en pez cebra depende altamente de la producción de flagelina; (3) La activación del inflamasoma dependiente de Gbp4 mejora la resistencia de las larvas de pez cebra e incrementa la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium; (4) Tanto Gbp4 mutante que carece de la actividad GTPasa, como el doble mutante al que también le falta el dominio CARD, se comportan como dominantes negativos, incrementando la susceptibilidad a S. Typhimurium y, en paralelo, reduciendo la actividad caspasa-1; (5) El mutante de Gbp4 sin el dominio CARD actúa, al igual que GBP5 de mamíferos, rescatando la elevada susceptibilidad de las larvas deficientes en Gbp4, pero no aumenta la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium en pez cebra; (6) Gbp4 regula el reclutamiento de neutrófilos al lugar de infección y, además, la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 esta mediada por los neutrófilos; (7) El inflamasoma dependiente de Gbp4 activa la biosíntesis de las prostaglandinas, que a su vez fomentan la eliminación de S. Typhimurium. INTRODUCTION: The nucleotide-binding domain leucine-rich repeats (NLRs) constitute a family of cytosolic pattern recognition receptors (PRRs), which are the responsible for the caspase-1-mediated processing and activation of pro-inflammatory cytokines, such us IL-1 β and IL-18, and the induction of a recently described form of cell death called pyroptosis. NLRs achieve these functions by forming multiprotein signaling platforms, called inflammasomes, which alert the immune system about the presence of infection or tissue damage. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Establishment of a zebrafish – Salmonella Typhimurium infection model to study inflammasome activation, assembly and function; (2) Characterization of the role of flagellin of S. Typhimurium in the infection mechanism in zebrafish; (3) Characterization of the role of zebrafish Gbp4 in inflammasome activation, assembly and clearance of S. Typhimurium; (4) Characterization of the role of neutrophils in the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium in zebrafish; (5) Characterization of the role played by the Gbp4 inflammasome in prostaglandin production and S. Typhimurium clearance. METHODOLOGY: The following methods were used in this doctoral thesis: yolk sac or ear infection assays with S. Typhimurium, caspase-1 activity assays of infected larvae, counting of neutrophils using different zebrafish transgenic lines with fluorescent neutrophils using live imaging, neutrophil recruitment assays, cell death analysis, luminescence assays for the measurement of Il1-β contents, flow cytometry and FACS-sorting of fluorescent cells, gene expression analysis, western blot, inflammasome reconstitution assays in HEK293 cells. RESULTS: Here we report that zebrafish Gbp4, an IFNγ-inducible GTPase harboring a C-terminal CARD domain, is expressed in neutrophils and is required for the inflammasome-dependent clearance of Salmonella Typhimurium in vivo. Despite the presence of the CARD domain, Gbp4 requires the universal inflammasome adaptor protein Asc for mediating its antibacterial function. In addition, the GTPase activity of Gbp4 is indispensable for the inflammasome activation, the neutrophil recruitment and the clearance of S. Typhimurium. Reconstitution of Gbp4-Asc complexes in human embryonic kidney cells (HEK293) revealed a macromolecular complex with an outer ring of Asc and an core of Gbp4. Mechanistically, Gbp4 is essential for the inflammasome-dependent release of prostaglandins, of which PGD2 is associated with the Gbp4-mediated bacterial clearance. Our results, therefore, point to GTPase-binding proteins as the key inflammasome adaptors required for prostaglandin biosynthesis and intracellular bacterial clearance by neutrophils in vivo. CONCLUSIONS: The above results suggest that: (1) Zebrafish is an excellent model to study inflammasome activation and function upon S. Typhimurium infection; (2) Intracellular recognition of S. Typhimurium in zebrafish highly depends on flagellin production; (3) Gbp4-dependent inflammasome activation improves zebrafish larvae resistance and increases caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection; (4) A Gbp4 mutant lacking GTPase activity, as well as a double GTPase and CARD mutant, behave as dominant negatives by increasing the susceptibility to S. Typhimurium and, in parallel, decreasing caspase-1 activity; (5) A Gbp4 mutant lacking the CARD domain acts as mammalian GBP5; that is, rescues the higher susceptibility of Gbp4-deficient larvae but fails to increase caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection in zebrafish; (6) Gbp4 regulates neutrophil recruitment to the site of the infection. In addition, the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium is mediated by neutrophils; (7) The Gbp4-dependent inflammasome activates prostaglandin biosynthesis, which in turn promotes S. Typhimurium clearance.
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Caracterización filogenética, molecular y funcional de nuevos miembros de la familia de la interluquina-1 de peces teleósteos= Phylogenetic, molecular and functional characterization of new interleukin-1 family members in teleost fish.
(2013-06-13) Angosto Bazarra, Diego; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Facultad de Biología
1. PALABRAS CLAVE Inmunidad, interleuquina-1, inflamasoma, piroptosis, actividad caspasa-1, Salmonella typhimurium, evolución, filogenia, sintenia, dorada, pez cebra, peces, teleósteos. 2. RESUMEN En la presente tesis doctoral se ha estudiado la evolución de las funciones del inflamasoma en peces, llegando a la conclusión de que tanto el inflamasoma como la caspasa-1 desencadenan muerte celular conocida como piroptosis, pero no son necesarios para el procesamiento de la IL-1. Además se ha desarrollado un modelo de infección en pez cebra para el estudio del papel del inflamasoma en la eliminación de bacterias intracelulares, como Salmonella. Por último, se ha descrito un nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, perteneciente exclusivamente a los peces teleósteos más avanzados evolutivamente. La identificación de este nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, ayuda a entender la evolución de esta familia de citoquinas en vertebrados e indica su gran complejidad. 3. SUMMARY In the present thesis, we have studied the evolution of the inflammasome functions in fish. We observed that inflammasome and caspase-1 trigger pyroptotic cell death but they are not involved in the processing of IL-1. In addition, we have developed a zebrafish-Salmonella infection model to study the role of the inflammasome in the clearance of intracellular bacteria. Finally, we have identified and characterized a new member of the IL-1 family, IL-1Fm2, which is exclusively present in most evolutionarily advanced teleosts. The identification of this new IL-1 family member helps to understand the evolution of this family of cytokines in vertebrates and point out to its complexity.
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Dinámica espacio-temporal del ictioplancton del Mar Menor (SE de España) y factores ambientales asociados
(2015-01-26) Quispe Becerra, Jhoni Ismael; Pérez Ruzafa, Ángel; Marcos Diego, Concepción; Departamento de Ecología e Hidrología
OBJETIVOS: Los objetivos de la presente tesis doctoral son describir la composición taxonómica de las larvas de peces que habitan las aguas del Mar Menor, conocer la distribución espacial y la dinámica temporal del ictioplancton en la laguna, analizar los factores ambientales que determinan dicha distribución y dinámica y, finalmente, valorar el papel de la colonización larvaria a través de los canales de comunicación con el mar abierto y las corrientes en la estructura del poblamiento ictiológico. METODOLOGÍA: El trabajo se ha llevado a cabo en el Mar Menor, laguna costera ubicada en el SE de la península ibérica, en el extremo oriental de la Región de Murcia. Se establecieron en la misma 20 localidades de muestreo donde se recogió material en 1997 y desde 2006 a 2012. Adicionalmente, durante 2009 y 2012 se sumaron 8 estaciones para estudiar la influencia del Mediterráneo adyacente, ubicándolas en la bocana interior de los tres canales de comunicación con el mar abierto y en el propio Mediterráneo. El diseño experimental de muestreo permite el análisis de las escalas espacio-temporales de variabilidad del poblamiento y de las condiciones ambientales. El material trabajado en la presente memoria proviene de un total de 3.342 muestras tomadas con arrastres sub-superficiales (0,5–2 m de profundidad), diurnos, circulares y con una duración de 7 minutos, utilizando una red de plancton estándar, de forma cónica, equipada con un flujómetro. Todos los huevos y larvas de peces fueron separados y contados, y éstas últimas fueron identificadas hasta especie. El análisis de las escalas de variabilidad se ha realizado mediante Permanova y para el estudio de la estructura del poblamiento y las variables ambientales que lo explican se han utilizado regresiones múltiples y análisis multivariantes de ordenación. RESULTADOS: Se colectaron un total de 55.262 huevos y se han examinado 185.135 especímenes de larvas y postlarvas de peces, pertenecientes a 24 familias, 48 géneros y 69 especies. De éstas, 15 especies son exclusivas de la laguna. En el Mediterráneo la riqueza de especies llega a 100, existiendo 46 que no penetran en la laguna como larvas. Las familias más abundantes han sido Gobiidae (64,49%), Engraulidae (16,76%), Blenniidae (16,54%) y Atherinidae (1,11%). A su vez, las especies dominantes fueron Gobius niger (34,65%), Engraulis encrasicolus (16,76%), Gobius paganellus (15,26%), Pomatoschistus marmoratus (8,72%), Parablennius pilicornis (7,83%), Salaria pavo (6,55%), Aphia minuta (2,96%), Gobius cruentatus (1,63%), Parablennius gattorugine (1,48%) y Gobius cobitis (1,08%). De las especies estudiadas, 23 (23,7%) son residentes en el Mar Menor o típicamente lagunares, 27 (27,8%) son migradoras o pobladores cíclicos regulares, 12 (12,4%) son pobladores ocasionales o irregulares y 28 (28,9%) son visitantes extraviados o esporádicos. La densidad media anual total de larvas de peces en la laguna fue de 613,27 (± 37,02) individuos por 1000 m3, muy superior a la encontrada en el Mediterráneo adyacente, de 126,05 (± 13,51) individuos por 1000 m3. CONCLUSIONES: El poblamiento ictioplanctónico lagunar muestra gran variabilidad espacio-temporal. Un 41,3% del poblamiento lagunar varía de un año a otro. No obstante, su dinámica presenta un ciclo estacional claro, con dos picos de abundancia, en primavera y en otoño. La mayoría de las especies de interés pesquero de las familias Mugilidae, Sparidae o Clupeidae en el ictioplancton lagunar solo aparecen testimonialmente, con abundancias relativas medias inferiores al 0,03%, indicando que su penetración en la laguna ocurre principalmente en fases juveniles La distribución espacial está relacionada principalmente con los patrones de circulación de la laguna y con la colonización a través de los canales de comunicación con el mar abierto a la que se superponen las condiciones tróficas asociadas a la entrada de nutrientes por la rambla del Albujón. Existe un importante componente aleatorio en la dinámica del poblamiento que probablemente forma parte de los mecanismos homeostáticos del ecosistema lagunar. La elevada riqueza y diversidad de especies acumuladas y la gran proporción de especies ocasionales y extraviadas sugieren un papel muy importante de los mecanismos de lotería competitiva. ABSTRACT OBJECTIVES: The objectives of this thesis are to describe the taxonomic composition of larval fish that inhabit the waters of the Mar Menor, knowing the spatial distribution and temporal dynamics of ichthyoplankton in the lagoon, analyze the environmental factors that determine this distribution and dynamics and finally assess the role of larval colonization through the channels of communication with the open sea and the currents in the structure of ichthyological settlement. METHODOLOGY: The study has been conducted in the Mar Menor coastal lagoon located in the SE of the Iberian Peninsula at the eastern end of the Region of Murcia. Material was collected in 20 sampling sites in 1997 and from 2006 to 2012. Additionally, during 2009 and 2012, 8 stations, located in the inner mouth of the three channels of communication with the open sea and in the Mediterranean, were added to study the influence of the adjacent open sea. The experimental sampling design allows the analysis of the spatio-temporal scales of variability of the assemblage and environmental conditions. A total of 3,342 samples were analyzed. They were collected using diurnal, circular subsurface tows (0.5-2 m deep), with a duration of 7 minutes, using a standard plankton net, equipped with a flowmeter. All eggs and fish larvae were removed and counted, and the latter were identified to species. The analysis of the scales of variability was performed using PERMANOVA. The study of the structure of the assemblage and the environmental variables that explain it has been made by using multiple regression and multivariate ordination analysis. RESULTS: A total of 55,262 eggs were collected and 185 135 specimens of fish larvae and post-larvae, belonging to 24 families, 48 genera and 69 species, were examined. Of these, 15 species are unique to the lagoon. In the Mediterranean species richness reaches 100, 46 of them do not penetrate the lagoon as larvae. The most abundant families were Gobiidae (64.49%), Engraulidae (16.76%), Blenniidae (16.54%) and Atherinidae (1.11%). In turn, the dominant species were Gobius niger (34,65%), Engraulis encrasicolus (16,76%), Gobius paganellus (15,26%), Pomatoschistus marmoratus (8,72%), Parablennius pilicornis (7,83%), Salaria pavo (6,55%), Aphia minuta (2,96%), Gobius cruentatus (1,63%), Parablennius gattorugine (1,48%) and Gobius cobitis (1,08%). 23 (23.7%) of the studied species are resident in the Mar Menor lagoon, 27 (27.8%) are migratory or regular cyclical residents, 12 (12.4%) are occasional or irregular residents and 28 (28.9%) are marine stragglers or casual visitors. The total annual average density of fish larvae in the lagoon was 613.27 (± 37.02) individuals per 1000 m3, much higher than that found in the adjacent Mediterranean that reach 126.05 (± 13.51) individuals/1000 m3. CONCLUSIONS: The lagoon ichthyoplankton shows large spatial and temporal variability. 41.3% of the lagoon assemblage varies from year to year. However, their dynamics presents a clear seasonal cycle, with two abundance peaks in spring and autumn. Most species of commercial interest of the families Mugilidae, Sparidae or Clupeidae are present in the lagoon ichthyoplankton just in testimony with relative abundances lower to 0.03%, indicating that penetration into the lagoon occurs mainly as juveniles. The spatial distribution is mainly related to the circulation patterns of the lagoon and to the colonization through the channels of communication with the open sea. Overlapping to this act the trophic conditions associated with nutrient inputs from the Albujón watercourse. There is a substantial random component in the assemblage dynamics which is probably part of the homeostatic mechanisms of the lagoon ecosystem. The high richness and diversity of species and accumulated large proportion of occasional and straggler species suggest an important role of the mechanisms of competitive lottery.
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Dispersal patterns and connectivity among mediterranean reef fish populations: the case of the saddled sea bream, Oblada melanura [Linnaeus, 1758] in the western mediterranean sea= Patrones de dispersion y conectividad entre poblaciones de peces de arrecifes mediterráneos: el caso de la doblada, Oblada melanura [Linnaeus, 1758] en el Mediterráneo occidental
(2016-12-15) Calò, Antonio; García Charton, José Antonio; Pérez Ruzafa, Ángel; Facultad de Biología
Los ecosistemas marinos costeros están sujetos a una multitud de impactos humanos, entre los cuales la sobrepesca está considerada como una de las amenazas más graves, y que conducen a una disminución de las poblaciones de peces en todo el mundo. Las áreas marinas protegidas (AMPs) pueden permitir la recuperación de las poblaciones de especies intensamente explotadas. Desde esta perspectiva, las poblaciones de peces protegidas suelen mostrar una mayor densidad de individuos de gran tamaño con respecto a poblaciones no protegidas. Un alta densidad de peces adultos de gran tamaño (individuos reproductores) dentro de las AMPs puede llevar a un alta producción de propágulos (huevos y larvas) que pueden ser retenidos localmente y/o exportados hacia fuera de los límites del AMP. Las poblaciones locales de peces están vinculadas entre sí demográficamente, y por lo tanto genéticamente, a través de la dispersión de individuos en forma de huevos, larvas, juveniles, subadultos o adultos. Este proceso se denomina "conectividad". La recogida de información sobre los patrones de dispersión y conectividad resulta fundamental para evaluar la escala espacial a la cual la exportación de propágulos de un AMP puede sostener poblaciones no protegidas exteriores u otras AMPs dentro de una red. En este contexto, con el fin de establecer redes de AMPs más eficientes es necesario mejorar el conocimiento sobre las características biológicas y ecológicas de las especies de peces, así como sus patrones de dispersión y conectividad. En este trabajo se utilizó un enfoque multidisciplinar a varias escalas espaciales para investigar los patrones de dispersión de las larvas y la conectividad de una especie de pez, la doblada - Oblada melanura (Linneo, 1758) en el Mediterráneo occidental. Los resultados se utilizaron para proporcionar conocimientos con el fin de mejorar las estrategias actuales de protección y gestión de las poblaciones de peces y de diseño futuro de las AMPs en la región considerada. A escala regional (500-1.000 km) se investigó el nivel de conectividad genética entre localidades protegidas y no protegidas, considerando 3 AMPs eficientes del Mediterráneo occidental (Parque Nacional de Port-Cros, Reserva Natural Integral de Cap Creus y Reserva Marina de Interés Pesquero de Cabo de Palos - Islas Hormigas. A escala local (100-150 km) se evaluaron los patrones de dispersión de propágulos y la conectividad demográfica entre las zonas marinas protegidas y áreas no protegidas a lo largo de la costa sudeste de España (Región de Murcia), utilizando el análisis micro-estructural y química de los otolitos y simulaciones de dispersión de propágulos. Los resultados genéticos indicaron que las localidades protegidas investigadas están bien conectadas con las localidades cercanas sin protección. Por otra parte, una señal de estructuración genética se registró a escala regional, lo que sugiere la presencia de barreras oceanográficas que pueden afectar a los flujos genéticos, incluso entre lugares cercanos, y que son potencialmente capaces de generar rupturas genéticas a escalas evolutivas de tiempo. Los resultados a escala local indicaron que la disposición espacial y la posición de las AMPs existentes a lo largo de la costa sur-oriental de la península Ibérica (Cabo de Palos - Islas Hormigas y Tabarca) no parece generar el intercambio óptimo de propágulos que se espera en las redes eficientes, probablemente debido a los factores ambientales que actúan en el área de estudio, especialmente la dinámica de las masas de agua. Desde esta perspectiva, el establecimiento de nuevas AMPs en el sector sur del litoral murciano es recomendable para mejorar el estado de conservación actual de la zona. Ciertamente, el análisis de una sola especie, aunque representativa de otras especies con características biológicas y ecológicas similares, resulta insuficiente para dibujar una imagen adecuada de los patrones de dispersión y de conectividad. Por lo tanto, sería importante aplicar el mismo procedimiento de investigación incluyendo especies con diferentes rasgos biológicos y ecológicos y cubriendo un mayor plazo temporal. Coastal marine ecosystems are subject to a multitude of human impacts with fishing considered one of the most serious threats, leading to a worldwide overexploitation of fish populations. For these reasons different conservation strategies and management measures are needed to preserve and restore the health of marine ecosystems. Marine protected areas (MPAs) can allow the recovery of populations of heavily exploited species. Protected fish populations, from this perspective, may display higher density and larger individual size than in fished conditions. A high density of large adult fishes (i.e. spawners) inside MPAs can lead to a high propagules (i.e. eggs and larvae) production that can be locally retained and/or exported toward outer fished areas or other MPAs within a network. Local fish populations are demographically linked to each other via dispersal of individuals at whatever life stage (i.e. eggs, larvae, juveniles, subadults or adults), also associated to an exchange of genes among populations. The whole mechanism is termed ‘connectivity’. The gathering of information on dispersal and connectivity is fundamental to assess the spatial scale over which fish populations interact and the scale over which they should be managed. In this context, in order to establish more efficient spatially explicit marine protection strategies, there is the need to improve our knowledge on dispersal and connectivity patterns and species biological and ecological traits that drive them, especially focusing on the propagule phase, considered the main responsible of species dispersal capacity. In this work we used a multidisciplinary and multi-scale approach to investigate patterns of propagule dispersal and connectivity in a Mediterranean coastal fish, the saddled sea bream Oblada melanura, in the western Mediterranean Sea. The outcomes were used for providing insights for the improvement of current fish management and protection strategies and the future design of MPAs in the region considered. At the regional scale (500-1000 km) we investigated the level of genetic connectivity between protected and unprotected locations, considering 3 efficient MPAs of the western Mediterranean Sea (Port-Cros national park, Cap Creus MPA and Cabo de Palos e Islas Hormigas MPA). At the local scale (100-150 km) we assessed patterns of propagule dispersal and demographic connectivity between MPAs and unprotected areas along the south-east coast of Spain (Murcia Region and southern Alicante province), using otolith micro-structural and chemical analysis and propagule dispersal simulations. Genetic results indicated that the MPAs investigated in the western Mediterranean Sea are well connected with their neighbouring unprotected sites. On the other hand, a signal of genetic structuring was recorded at the regional scale, suggesting that the presence of oceanographic barriers can affect genetic flows even between close locations and potentially able to generate genetic breaks over evolutionary time scales. For this reason it is important to monitor the evolution of genetic dynamics between populations, including other species with different biological and ecological characteristics. At the local spatial scale results from otolith analysis and dispersal simulations indicated that the spatial arrangement and the position of the existing MPAs along the south-eastern coast of Spain (Cabo de Palos e Islas hormigas MPA and Tabarca MPA) could not generate the optimal interchange of propagules, expected in efficient networks, probably due to environmental determinants acting in the study area, especially the dynamic of water masses. In addition Cabo de Palos MPA and Tabarca MPA, despite their potential propagule production, could not guarantee a sufficient supply of individuals toward the southern unfished areas of the region. From this perspective, the establishment of new MPAs in the southern sector of the region is advisable for improving the current conservation status of the area. Certainly, the analysis of a single species, although representative of other species with similar biological and ecological characteristics, cannot be enough for drawing an adequate picture of dispersal and connectivity patterns. Thus, it would be important to apply the same investigation procedure including species with different biological and ecological traits and over a longer temporal domain. However, as already pointed out in other works, this study demonstrates that effectiveness of combining complementary tools for investigating patterns of propagule dispersal and connectivity.
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Distribución espacial del ictioplancton en aguas neríticas y oceánicas del SE. Ibérico, en marzo de 1999 / Inmaculada Vidal Peñas.
(Murcia : Universidad,, 2000) Vidal Peñas, Inmaculada
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Efecto de la testosterona en el sistema reproductor e inmunitario de la dorada (Sparus aurata L.). Identificación de una variante constitutivamente activa del receptor de andrógenos.= Effect of testosterone on reproductive and immune systems of gilthead seabream (Sparus aurata L.). Identification of a constitutively active androgen receptor variant
(2014-01-09) Sánchez Hernández, Miriam; García Alcazar, Alicia; García Ayala, Alfonsa; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Facultad de Biología
En la siguiente Tesis Doctoral hemos analizado la influencia de la testosterona (T) exógena sobre el metabolismo de esteroides sexuales y la fisiología de la gónada de la dorada (Sparus aurata L.). Además hemos descrito la presencia de un mecanismo de procesamiento alternativo del ARN, para el receptor de andrógenos (AR), cuya expresión varía con el estado reproductor y se correlaciona con el nivel de T. Esta forma truncada del AR está presente en los granulocitos acidófilos (GAs), descubriéndonos así nuevos mecanismos de regulación en la biología de los neutrófilos de vertebrados. El uso de la dorada como ejemplar de estudio se debe a que es una especie de alto interés comercial en el Mar Mediterráneo. La dorada es un teleósteo marino que presenta un hermafroditismo protándrico, siendo los ejemplares machos durante sus dos primeros años de vida, y pudiendo cambiar de sexo a partir del segundo año. El ciclo reproductor (CR) de los ejemplares macho se caracteriza por presentar cuatro etapas secuenciales: espermatogénesis (ES), puesta (P), post-puesta (PP) y quiesciencia (Q) durante el primer CR. La etapa de Q es sustituida por una etapa de involución testicular (IT), en el segundo CR que permite el cambio de sexo. Tras la puesta, el testículo suele sufrir una serie de cambios morfológicos, entre los que se encuentra una infiltración masiva de leucocitos, la cual es mayor en la etapa IT, antes del cambio de sexo. En primer lugar, quisimos comprobar la capacidad de la T exógena para modificar el balance de las hormonas sexuales esteroideas y la fisiología de la gónada. Con este fin, incorporamos la T en las doradas utilizando el sistema de micropartículas in situ (ISM) (T-ISM). La T exógena promueve un incremento supra-fisiológico en los niveles plasmáticos de T y una disminución de los niveles de 17β-estardiol (E2). Sin embargo, no se vieron alterados los niveles de 11-cetotestosterona (11KT). La T, además, bloquea la proliferación de las células germinales del testículo aunque el incremento en la expresión del gen que codifica para dmrt1 podría prevenir la eliminación completa de las células germinales. Por otra parte, comprobamos que los andrógenos, al igual que había sido demostrado para los estrógenos, están implicados en la migración de leucocitos hacia la gónada. Además, la T de los T-ISM promueve una disminución de la expresión de los genes que codifican receptores Toll-like (tlrs), quedando inhibida la capacidad de reconocer y responder a patógenos. Posteriormente, identificamos una variante, constitutivamente activa, del AR que carece de dominio de unión al ligando (ARΔLBD) en testículo y riñón cefálico (RC) de dorada y su expresión varía con el estado reproductor y con los niveles plasmáticos de testosterona. Esta variante se forma por un procesamiento alternativo del ARNm del AR. Nuestros datos sugieren que este procesamiento alternativo es capaz de modificar la fisiología del testículo, debido a que los andrógenos son capaces de modular el procesamiento alternativo del AR. Además, los andrógenos, concretamente la T, es capaz de regular la respuesta inmunitaria a través de la variante ARΔLBD. Otro dato interesante es que sólo los AGs expresan esta forma truncada mientras que los macrófagos (MØs) no la expresan. Además, el procesamiento alternativo del AR también no sólo se ve modulado por T, sino también por estímulos inmunitarios, aunque esta modulación depende del estado reproductor de los individuos. Todos estos datos nos indican una interacción entre los estímulos endocrinos e inmunitarios en la regulación del procesamiento alternativo del AR así como de las funciones de los AGs. Además, la T podría estar implicada en los cambios fisiológicos de la gónada a través de la regulación del ARΔLBD. During the development of this thesis, we want to analyze the effect of exogenous androgens, mainly testosterone (T), and the activity of androgen receptor (AR) in immune-reproductive interaction in the sparidae, gilthead seabream (Sparus aurata L.). Furthermore, we described the presence of a mechanism, in which the unique AR gene can give diverse transcripts either in testis or immune organs. The gilthead seabream is a marine, protandrous teleost fish with significant economic value in the Mediterranean aquaculture. The specimens of this specie are male during the two first years, and present a reproductive cycle (RC) divided in four stages. In first RC, the stages are spermatogenesis (SG), spawning (S), post-spawning (PS) and resting (R); in the second RC, the last stage is substituted by testicular involution (TI) stage. After spawning there are various changes in gonad, between which are a massive infiltration of leukocytes, being higher in TI and that can lead to sex change. For this motive this specie can being used as a model for studying the immune-reproductive interactions. In first place, we wanted to observe the capacity of exogenous T to modify the balance of sex steroid hormones and on the physiology of the gonad (proliferation, apoptosis, leukocyte influx and immune status) of mature male specimens of the gilthead seabream. To this end, we used the in situ forming microparticle (ISM) system, which delivers sex steroids without promoting significant physiological alterations in gilthead seabream and that has been previously used in our laboratory to show that T modulates the inflammatory response of head kidney (HK) leukocytes in the gilthead seabream. The results suggest that in mature males, exogenous T can blocked the cell proliferation and increase the migratory influx of leukocyte, although decrease the ability to recognize and response to pathogens. Secondly, we identified a truncated form of the AR generated by alternative splicing that lacks the ligand-binding domain (ARΔLBD) either in testis, HK and acidophilic granulocytes (AGs). We studied the modulation of this variant by androgens and immune stimulus in order to demonstrate its mediation in the role of androgens in the immune response. The results showed that T is able to regulate the testicular morphology through the modulation of the expression of ARΔLBD variant. Furthermore, T was also able to regulate the immunecompetence through ARΔLBD variant. Interestingly, ARΔLBD variant only is expressed in AGs but no in macrophages (MØ). Furthermore, the stimulation with bacterial DNA, also regulated the alternative splicing of AR, but depending of the reproductive stage. These data suggest a crosstalk between endocrine and immune stimuli in the regulation of AR alternative splicing and AGs function. Furthermore, T might be implicated, in the migratory influx into gonad and the physiological changes in gonad through by means of regulation of ARΔLBD.
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Efecto del 17a-etinilestradiol sobre el sistema inmunitario y reproductor de la dorada (Sparus aurata L.). Caracterización funcional del receptor de estrógenos asociado a proteína G = Effect of 17a-ethinylestradiol on inmune and reproductive system of the gilthead seabream (Sparus aurata L.). Functional characterization of the G protein-couplet estrogen receptor
(2013-09-04) Cabas Sánchez, Isabel; García Ayala, Alfonsa; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Meseguer Peñalver, José; Facultad de Biología
OBJETIVOS: 1. Evaluar la capacidad del EE2 de provocar una respuesta estrogénica en vivo en ejemplares macho de dorada 2. Evaluar la capacidad del EE2 de alterar la fisiología y la respuesta inmunitaria local de la gónada 3. Evaluar la habilidad del EE2 de alterar la respuesta inmunitaria sistémica, analizando actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico, el perfil de expresión de macrófagos y la capacidad en vivo de responder a un reto inmunológico. 4. Realizar una caracterización funcional del receptor de estrógenos asociado a proteína G tanto in vitro como in vivo. METODOLOGÍA: Se llevo realizó una experimentación in vivo e in vitro. Se usaron ejemplares sanos de dorada (Sparus aurata L.), especie hermafrodita protándrica y de puesta estacional, mantenidos en el Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). La experimentación in vivo se llevo a cabo exponiendo a los ejemplares a EE2 o G1 a diferentes dosis y tiempos. En algunos casos, la exposición se simultaneó con una inmunización programada. A continuación, se realizaron, entre otros, análisis de supervivencia, de calidad del esperma, histológicos, determinación de hormonas e IgM en suero, de expresión génica y de citometría de flujo. La experimentación in vitro se desarrollo, principalmente, tratando con leucocitos de riñón cefálico con EE2 o G1 (para la activación específica de la señalización de GPER para su caracterización funcional) a diferentes dosis y tiempos y analizando actividades inmunitarias como fagocitosis y explosión respiratoria y el perfil de expresión génica. CONCLUSIONES: 1. La exposición in vivo a EE2 promueve una respuesta estrogénica evidente caracterizada por un descenso en el IGS, alteración en los niveles séricos de E2, T y 11KT y una inducción en la expresión hepática de vtg. Estos efectos son más evidentes cuando el EE2 se administra en la dieta que cuando se administra en el agua del baño. Además, estos efectos dependen, ligeramente, del estado de desarrollo de los ejemplares. 2. El EE2 incrementa la sensibilidad a estrógenos en gónada y en riñón cefálico ya que aumenta la expresión del REα. 3. La exposición in vivo a EE2 interrumpe la espermatogénesis e induce en el testículo la morfología característica de la etapa de post-puesta. Aunque los túbulos seminíferos continúan llenos de espermatozoides se observa una reducción en el volumen y motilidad de los espermatozoides. Además, el EE2 genera un proceso pro-inflamatorio en la gónada, promoviendo una infiltración masiva de leucocitos y un incremento en la expresión de citoquinas y moléculas implicadas en el reconocimiento y presentación de antígenos. 4. El EE2 disminuye la capacidad de los ejemplares de responder a un estímulo inmunológico in vivo ya que inhibe la producción de citoquinas pro-inflamatorias tras una inmunización aunque no se comporta como inmunosupresor. Además, el EE2 inhibe in vitro las actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico y dirige hacia un fenotipo anti-inflamatorio en macrófagos. 5. EL GPER se expresa en tejidos reproductores e inmunitarios de dorada y su expresión no es modulada por su activación. 6. Los granulocitos acidófilos son las células del riñón cefálico que tienen un mayor nivel de expresión de GPER. Éstos expresan un GPER funcional cuya activación in vitro dirige, de manera general, hacia un fenotipo anti-inflamatorio. Dichos efectos son regulados, en parte, por la activación de la ruta de señalización AMPc/PKA/CREB. 7. La activación de GPER no promueve una respuesta estrogénica aunque provoca, en general, un efecto anti-inflamatorio y modula ligeramente la respuesta inmunitaria adaptativa. OBJETIVES: 1. To evaluate the ability of EE2 to provoke an estrogenic response in vivo in male gilthead seabream. 2. To evaluate the ability of EE2 to alter the physiology and the local immune response of the gonad. 3. To evaluate the ability of EE2 to alter the systemic immune response, analysing immune activities of head kidney leukocytes, the expression profile of macrophages and the in vivo capabilities to respond to an immune challenge. 4. To perform a functional characterization of the G protein-coupled estrogen receptor, GPER, both in vitro and in vivo. METHODOLOGY: In vivo and in vitro experimentation was carried out. For this, healthy specimens of gilthead seabream (Sparus aurata L.) were bred and kept at the Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). In vivo experiments were carried out by exposing the specimens to EE2 or G1 at different doses and times. In some cases, the exposure was simultaneous to a scheduled immunization. Afterwards, analysis of survival, sperm quality, histological, determination of hormones and IgM in serum, gene expression and flow cytometry were performed. In general, for the in vitro experiments, leukocytes from head kidney (bone marrow equivalent) were treated with several doses of EE2 and G1 (to specifically activate GPER signalling) at different time points, and analyzing immune activities such as phagocytosis and respiratory burst and gene expression profile. CONCLUSIONS: 1. Exposure to EE2 in vivo promotes an evident estrogenic response characterized by decreased GSI, altered serum levels of E2, T and 11KT, and induced hepatic expression of vtg. These effects are more evident when EE2 is administered in the diet than when is administered in bath water. In addition, its effects slightly depend on the development stage of the specimens. 2. EE2 increases the sensitivity to estrogens in the gonad and the head kidney by increasing the expression of the gene coding for ERα. 3. Exposure to EE2 in vivo disrupts spermatogenesis and induces a characteristic morphology of the post-spawning in the testis. However, the seminiferous tubules were filled with sperm, causing a reduction in the volume and sperm motility. Moreover, EE2 also generates a pro-inflammatory process in the gonad, promoting a massive infiltration of leukocytes and an increased expression of the genes encoding cytokines and molecules involved in antigen recognition and presentation. 4. EE2 decreases the ability of specimens to respond to an immune stimulus in vivo by inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines after immunization but does not behave as an immunosuppressor. Moreover, EE2 inhibits in vitro the immune activities of head kidney leukocytes and direct primary macrophages towards an anti-inflammatory phenotype. 5. GPER is expressed in reproductive and immune tissues in gilthead seabream and its expression is not modulated by its activation. 6. Acidophilic granulocytes are the head kidney cells with a higher level of expression of GPER. They express a functional GPER whose activation in vitro leads, in general, to an anti-inflammatory phenotype. These effects are regulated, in part, by activation of the cAMP/PKA/CREB signalling pathway. 7. GPER activation in vivo does not promote an estrogenic response, although in general, provokes an anti-inflammatory effect and slightly modulates the adaptive immune response.
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Estrogens regulate the innate and the adaptive immune response = Regulación de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa por los estrógenos
(2017-05-15) Ródenas Bleda, María del Carmen; García Ayala, Alfonsa; Meseguer Peñalver, José; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Facultad de Biología
Abstract Endocrine disrupting chemicals (EDCs) are a class of heterogeneous chemicals present in the environment that bind to estrogen receptors (ERs) and interfere with the estrogen-dependent control of body homeostasis. In the present thesis, we present evidence that EDCs modulate the immune system of gilthead seabream (Sparus aurata L.) even when exposure to these chemicals has ended. We evaluate the effect of 17α-ethinylestradiol (EE2), a bio-active estrogen used in oral contraceptive pills, and tamoxifen (Tmx), a drug used worldwide for the treatment of ER-positive breast cancer. Both have become a widespread problem in the environment due to their high resistance to degradation. The gilthead seabream is a marine teleost fish of significant economic value in the Mediterranean area and has been extensively used in research as a protandrous hermaphrodite fish. Furthermore, during the development of the thsesis we identified a membrane-anchored receptor called G protein-coupled estrogen receptor (GPER1) in human neutrophils. The thesis was carried out in four stages. First of all, we confirmed that EE2 and Tmx, incorporated in the diet, promote an estrogenic response in adult fish although the effect of Tmx was seen to be much less pronounced. We also investigated the capacity of both compounds to modulate the immune response induced by an antigenic challenge and its capacity to recover its functionality when the treatments ceased. Both EE2 and Tmx transiently inhibited the induction of interleukin-1β (il-1β) gene expression and transiently increased reactive oxygen species (ROS) in head kidney leukocytes from vaccinated fish. Moreover, EE2 and Tmx increased the antibody titer but only the fish exposed to Tmx showed a higher IgM titer and a higher percentage of IgM+B lymphocytes during the recovery period. After observing that EE2 and Tmx affected the immune response of adult specimens, we attempted to ascertain whether these effects are also produced in juveniles. Moreover, it was seen that treatment with G1, a GPER-selective agonist, also altered the immune response of adult specimens. Only EE2 and Tmx differently increased vtg mARN levels during the treatment and the expression returned to basal levels during recovery. Although none of the three compounds affected ROS production, they all inhibited the induction of il1b gene expression after priming. Significantly, Tmx increased the percentage of IgM+ cells in both head kidney and spleen during the recovery period. More importantly, the antibody response of vaccinated fish was modified by the three compounds but the exact effects depended on the time when the immunization was performed. The previous results led us to investigate the influence of EE2 on the innate immune response, focusing on lymphocytes and in the humoral activity when exposure to this EDC ceased. Significantly, EE2 affects the percentage and proliferation of T and IgM+-B lymphocytes. For the first time it was seen that EE2 significantly induces the production of antibodies, an effect mediated through GPER1 signalling pathway. Finally, we functionally characterized GPER1 in human neutrophils. These cells express a functional GPER1 in the plasma membrane and stimulation of the neutrophils with G1 resulted in a dose-dependent increase in transcript levels of CFOS, a marker of GPER1 activation. Besides, G1 significantly primed the production of O2- and drastically altered their gene expression profile. G1 treatment regulated the activation and life span of human neutrophils through several signaling pathways. To sum up, our results show for the first time that GPER1 activation promotes the polarization of human neutrophils towards a pro-inflammatory phenotype and identify GPER1 as a potential therapeutic target in immune diseases where neutrophils play a key role. Resumen En el transcurso de esta Tesis Doctoral se ha explorado el efecto del 17α-etinilestradiol (EE2) y del tamoxifeno (Tmx) sobre el sistema inmunitario de la dorada (Sparus aurata L.) durante y después de la exposición a estos compuestos. El primero es un estrógeno sintético siendo el principal ingrediente activo de la píldora anticonceptiva, mientras que el Tmx es un modulador selectivo de los receptores de estrógenos con efecto anti-proliferativo en el tejido mamario. Debido al amplio uso y a la incompleta degración, son contaminantes habituales de los medios acuáticos. La dorada es un pez teleósteo marino y una de las especies por excelencia de la acuicultura marina, con un gran valor en la acuicultura mediterránea. Además se ha determinado el papel del receptor de estrógenos asociado a proteína G, GPER1 en la biología de neutrófilos humanos. En primer lugar, hemos evaluado el efecto del EE2 y del Tmx administrados mediante dieta en determinados marcadores de disrupción estrogénica en doradas adultas. Hemos confirmado que el EE2 provoca una respuesta estrogénica y que el Tmx también altera estos marcadores, aunque el efecto fue menos pronunciado. También hemos investigado la capacidad de ambos compuestos de modular la respuesta inmunitaria inducida tras una vacunación así como su capacidad de recuperación tras el cese de la exposición. Los resultados indican que el EE2 y el Tmx inhiben de manera transitoria la inducción de la expresión del gen inteleuquina 1β (IL)-1β e incrementan la producción de intermediarios de oxígeno reactivos (ROIs) en leucocitos de riñón cefálico (RC) de peces vacunados. Por otro lado, el EE2 y el Tmx estimulan la producción de anticuerpos en peces vacunados aunque sólo en los expuestos a Tmx se produjo una alteración del porcentaje de linfocitos (Ly) B inmunoglubulina M positivos (IgM+) en peces durante el periodo de recuperación. Tras observar que el EE2 y el Tmx alteran la respuesta inmunitaria de ejemplares adultos, nos planteamos determinar si estas consecuencias se producen también en juveniles. Además introdujimos el compuesto G1, agonista específico de GPER ya que también altera la respuesta inmunitaria de adultos de dorada. El EE2 y el Tmx, pero no el G1, promueven una respuesta diferente y transitoria en la expresión del gen hepático de la vtg. Aunque estos tres compuestos no afectan la producción de ROIs, provocan la inhibición de la inducción de la expresión del gen il1b, al igual que ocurría en adultos. Destacamos, que a pesar de que el Tmx incrementa el porcentaje de Ly B-IgM+ RC y en bazo durante el periodo de recuperación, la producción de anticuerpos en peces vacunados varía dependiendo del compuesto utilizado y de cuando se produjo la vacunación. Los resultados previos nos llevaron a investigar la influencia del EE2 en la respuesta inmunitaria centrándonos en los Ly y en la actividad humoral tras el cese de la exposición. En concordancia con lo anteriormente observado, el EE2 incrementa la expresión del gen hepático de la vtg. De manera significativa, afecta al porcentaje y a la capacidad de proliferación de los Ly T y B-IgM+. Además, describimos por primera vez que el EE2 induce la producción de anticuerpos y que este efecto está mediado a través de la señalización por GPER1. Finalmente, dado que los estrógenos son capaces de modular funciones de granulocitos en dorada a través de la señalización por GPER, hemos realizado la caracterización funcional de GPER1 en neutrófilos humanos. Estas células expresan GPER1 de manera funcional en la membrana plasmática, ya que tras la activación in vitro con el agonista especígico G1, produjo el incremento de los niveles de transcripción de CFOS, marcador de activación de GPER1. Además incrementa la producción ROIs y altera de manera drástica el perfil de expresión de genes, además de incrementar la viabilidad de neutrófilos humanos a través de diferentes mecanismos de señalización. En definitiva, nuestros resultados muestran por primera vez que la activación de GPER1 produce la polarización de neutrófilos humanos hacia un fenotipo pro-inflamatorio y pone de manifiento la potencia de GPER1 como diana terapéutica en enfermedades inmunitarias en los que los neutrófilos juegan un papel fundamental.
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Estudio de la función de la hormona estimuladora del folículo de lubina: su implicación en la espermatogénesis y sus rutas de señalización intracelular
(2014-12-15) Mazón Moya, Mª José; Zanuy Doste, Silvia; Gómez Peris, Ana; Departamento de Biología Celular e Histología
El proceso reproductivo en peces, al igual que en el resto de vertebrados, está regulado por una cascada hormonal en la que están implicados el cerebro, la hipófisis y las gónadas, conocido como eje CHG. Dos de las principales hormonas implicadas en el control de la reproducción son las gonadotrofinas FSH (hormona estimuladora del folículo) y LH (hormona luteinizante), ambas producidas en la hipófisis y liberadas tras el estímulo con las hormonas liberadoras de gonadotrofinas (GnRH) y con acción a nivel gonadal. Desde la perspectiva de la producción animal en general, y de la acuicultura en particular, es esencial conocer en la especie a domesticar los mecanismos básicos de control endocrino. Este conocimiento básico es de gran utilidad para poder manipular la reproducción a conveniencia y al mismo tiempo poder desarrollar estrategias terapéuticas para solventar problemas de fertilidad que en ocasiones presentan los stocks de reproductores. Sin embargo, como consecuencia de la limitación en la disponibilidad de herramientas para su estudio, para una gran mayoría de las especies cultivables de peces se desconocen los mecanismos particulares que controlan su reproducción. En esta Tesis se optimiza una alternativa nueva de administración de gonadotrofinas recombinantes, la tecnología conocida como transferencia génica somática. En los capítulos 3 y 4 se inyectaron adultos y juveniles de lubina con construcciones de DNA codificante de las gonadotrofinas de cadena única Lh y Fsh, respectivamente, y se evaluó el incremento de estas hormonas en el torrente sanguíneo. En ambos experimentos las inyecciones de DNA se compararon con la inyección directa de la gonadotrofina recombinante correspondiente. Estos capítulos muestran que las construcciones de DNA se incorporan a las células musculares en el lugar de inyección, y las hormonas codificadas son sintetizadas y liberadas al torrente sanguíneo. Los capítulos 3 y 4 confirman que la transferencia génica somática es una herramienta poderosa para realizar estudios funcionales in vivo con gonadotrofinas, siendo además útil como terapia hormonal en peces, presentándose como alternativa a los tratamientos tradicionales con hCG o GnRH. La funcionalidad de las hormonas recombinantes sintetizadas por las células musculares de lubina tras la incorporación del DNA, se determinó estudiando su efecto en el desarrollo de los testículos. En los capítulos 4 y 5 se evaluó como la acción de la Fsh es esencial para iniciar el proceso de espermatogénesis, promoviendo la proliferación de las espermatogonias, siendo necesaria la acción posterior de la Lh para culminar la espermiación. Los individuos inyectados sólo con el plásmido de Fsh presentaron una espermatogénesis parcial, sin indicios de espermiación, estado que sólo alcanzaron aquellos animales que se inyectaron de manera secuencial con los plásmidos de Fsh y Lh. Estos experimentos también demuestran que la Lh por si sola no es capaz de promover la maduración testicular. Además en los análisis de expresión génica se observó que los tratamientos con Fsh incrementaron la expresión de marcadores de células germinales como piwi, pcna y scp3, mientras que el efecto de la Lh se detectó en enzimas esteroidogénicas como cyp17a1 y cyp17a2. En esta Tesis también se describe cómo una de las acciones más directas de la Fsh es la estimulación de la producción de 11KT. Con el fin de analizar más en detalle la acción específica de la Fsh en la activación de la esteroidogénesis, y de definir mecanismos de regulación conservados entre diferentes especies de peces, se estudió in vitro la acción de la Fsh en cultivo primario de testículo y ovario de lubina y pez cebra. En el capítulo 6 se describe cómo la Fsh emplea principalmente la ruta del AMPc/PKA para transmitir su señal una vez activado su receptor, no siendo ésta la única vía, ya que también es importante la actividad de las MAPK. Haciendo uso de inhibidores y estimuladores de ambas rutas se ha perfilado un escenario en el que la Fsh utiliza de manera independiente las rutas del AMPc/PKA o las MAPK para estimular la transcripción de genes implicados en la esteroidogénesis, como star o cyp19a1a ABSTRACT The reproductive process in fish, as in all vertebrate species, is tightly regulated by a hormonal axis, called BPG, involving the brain, pituitary and gonads. Two major hormones that control reproduction are the gonadotropins FSH (follicle-stimulating hormone) and LH (luteinizing hormone) are both produced at the pituitary level, released to the bloodstream after the stimulus of the GnRH (gonadotropin release hormone), and with action at the gonad level. From a fish farming perspective, it is essential to fully understand the endocrine mechanism underlying reproductive performance. This knowledge is important to manipulate reproductive behaviour and for the development of therapeutic strategies aiming to solve fertility issues frequently present in the broodstocks. However, due to the limited tools available for the vast majority of the cultivable species, the mechanisms controlling their reproduction are not well characterized. This thesis describes an alternative administration of recombinant gonadotropins using the technique of somatic gene transfer. In Chapters 3 and 4, adult and juvenile sea bass were injected with a plasmid DNA encoding Lh and Fsh gonadotropin sequences in a single chain form, and the levels of either GtHs were analysed in the bloodstream. In both experiments the plasma levels of GtHs attained by plasmid DNA injected fish were compared with plasma levels of fish injected with the equivalent recombinant GtH. Both Chapters clearly show that plasmid DNA was efficiently incorporated by the cell muscle, and the encoded hormones were synthetized and released to the bloodstream. These results confirm that somatic gene transfer can be a powerful tool for in vivo functional studies of gonadotropin. In addition, this technique can be used for hormone therapy in fish, and can offer a useful alternative to classic treatments with hCG or GnRH. The functionality of the recombinant hormones synthetized by cell muscles after plasmid DNA injection was evaluated by studying the development of testes. Chapters 4 and 5 describe the crucial role of Fsh in starting the process of spermatogenesis, promoting the proliferation of spermatogonia cells, and its requirements for Lh to reach the spermiation process. Fish receiving only Fsh plasmid injections showed partial spermatogenesis, with no evidence for spermiation. Only the fish injected with Fsh and Lh plasmid sequentially reached this late step of the spermatogenesis process. Fish receiving Lh plasmid alone showed that GtH cannot trigger testis maturation alone. Furthermore, gene expression analysis highlighted the action of Fsh on promoting cell proliferation by increasing the expression of germ cell markers such as piwi, pcna piwi, pcna and scp3. By contrast, the effect of Lh was more obvious in transcript levels of steroidogenic enzymes such as cyp17a1 and cyp17a2. This thesis additionally describes a direct action of Fsh on the stimulation of 11KT production. In order to analyse the specific activity of Fsh on the steroidogenesis process in detail, and to define regulatory mechanisms conserved across fish species, the action of Fsh in vitro was studied using primary gonad tissue culture from sea bass and zebrafish. Chapter 6 describes the use of the signalling pathway cAMP/PKA by Fsh to transduce the signal after the activation of its receptor not clear. Importantly, cAMP/PKA is not the only pathway used by Fsh, the MAPk route is also involved in Fsh signal transduction. The use of cAMP/PKA and MAPk inhibitors and stimulators suggest the possibility that Fsh can use both routes independently to activate the transcription of some steroidogenic genes such as star and cyp19a1a
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Estudio Histoquimico de la musculatura lateral de la carpa (Cyprinus Carpio)(1989)
(Universidad de Murcia, Servicio de publicaciones., 1989) Ramírez Zarzosa, Gregorio J.; Gil Cano, Francisco; Moreno Medina, Francisco; Vázquez Autón, José María; Latorre Reviriego, Rafael; Facultad de Veterinaria
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Estudio histoquímico y morfométrico de la musculatura lateral de diferentes especies de peces teleósteos marinos del sureste español / Ignacio Ibabe Martínez ; director Francisco Gil Cano.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria,, 1997) Ibabe Martínez, Ignacio; Gil Cano, Francisco
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Fisiología del envejecimiento en peces teleósteos del género Nothobranchius
(2014-04-11) Lucas Sánchez, Alejandro; Costa Ruiz, Jorge de; Mendiola López, Pilar; Almaida Pagán, Pedro Francisco; Facultad de Biología
El objetivo de esta Tesis Doctoral, titulada “Fisiología del envejecimiento en peces teleósteos del género Nothobranchius” es caracterizar el envejecimiento de dos especies del género Nothobranchius (N. korthausae y N. rachovii), considerando aspectos hasta ahora no estudiados en este género: las variaciones relacionadas con el envejecimiento en la composición de las membranas lipídicas mitocondriales, concretamente de las distintas especies fosfolipídicas y los ácidos grasos que las integran, y los cambios en el sistema circadiano (CS) con la edad, considerando el ritmo de actividad locomotora como marcador de su funcionamiento. En primer lugar, se estableció una colonia permanente de estas especies en el Laboratorio de Cronobiología de la Universidad de Murcia. De este modo, se pudo disponer de individuos de cada una de las etapas del ciclo vital. Con el objetivo de determinar las variaciones relacionadas con el envejecimiento en la composición de las membranas lipídicas mitocondriales, se procedió en primer lugar a la separación de las mitocondrias del resto de componentes celulares en muestras de individuos de diferentes edades, usando para ello centrifugaciones seriadas en un gradiente de sacarosa, para después proceder a la extracción del lípido total de acuerdo con el método de Folch. A partir del lípido total mitocondrial, se separaron y cuantificaron las distintas fracciones fosfolipídicas mediante cromatografía de capa fina y se obtuvieron los perfiles de ácidos grasos de cada una de ellas mediante transmetilación catalizada por ácido y cromatografía gas-líquido. El funcionamiento del CS de los peces se midió a través del estudio del ritmo de actividad locomotora. Para ello, se situaron individuos de diferentes edades en cámaras específicamente diseñadas. Estas cámaras estaban dotadas de fotocélulas que registraban constantemente la actividad de los peces y enviaban la información a una placa de registro en un sistema informático. De este modo, se obtenían series temporales de datos que eran analizadas mediante un software específico para ritmos circadianos así como métodos analíticos desarrollados para esta Tesis Doctoral. Las dos especies de Nothobranchius estudiadas mostraron cambios morfológicos fácilmente identificables a simple vista, como una pérdida patente de coloración, pérdida de peso y curvatura de la espina dorsal. A nivel bioquímico, los peces mostraron membranas mitocondriales altamente insaturadas, lo cual está relacionado con una alta tasa metabólica y alto estrés oxidativo y es característico de especies que, como las dos estudiadas, presentan fases de crecimiento explosivo. Unas membranas mitocondriales altamente insaturadas están también relacionadas con un ciclo vital corto, debido a la alta tasa de oxidación de las moléculas mitocondriales, principalmente los lípidos de membrana, que desemboca en disfunción y apoptosis. Las membranas mitocondriales podrían ser los marcapasos de toda una serie de procesos que llevan al deterioro progresivo e irreversible que caracteriza al envejecimiento. Estos procesos afectarían a la funcionalidad de los sistemas fisiológicos del animal y aumentaría la fragilidad del individuo, que se mostraría incapaz de responder a estreses inesperados del ambiente. Los resultados del presente trabajo ponen de manifiesto que el CS de Nothobranchius es severamente afectado con la edad y su deterioro podría ser uno de los factores desencadenantes de las últimas etapas del proceso de envejecimiento. Esta Tesis Doctoral pone de manifiesto la idoneidad de la utilización de especies del género Nothobranchius como modelos para estudios de envejecimiento dadas sus características como un reducido ciclo vital, el bajo costo para su cría y mantenimiento en el laboratorio y por presentar un envejecimiento gradual fácil de caracterizar y extrapolable a humanos. Estas especies se han mostrado además útiles para testar el uso de agentes cronobióticos como la melatonina, abriendo todo un abanico de posibilidades para estudiar en el futuro cercano posibles tratamientos frente al envejecimiento. The purpose of this Doctoral Thesis, entitled “Physiology of ageing in teleost fish of the genus Nothobranchius”, is to characterise the ageing process of two different species of the genus Nothobranchius (N. korthausae and N. rachovii) considering novel aspects never studied before in this genus: age-related variations in the mitochondrial lipid membrane composition, particularly in the different phospholipid classes and fatty acids which compose them, and the age-related changes in the circadian system, using the locomotor activity rhythm as a circadian system status indicator. Firstly, a permanent colony of these species was established in the Chronobiology Laboratory of the University of Murcia. Thereby it was possible to have individuals of each stage of the life cycle. In order to determine the age-related variations in the mitochondrial lipid membrane composition, the first step was to separate the mitochondria from other cellular components in samples obtained from fish of different ages, using serial centrifugations in a sucrose gradient. And the second step was proceeding with the total lipid extraction according to the Folch method. The different phospholipidic fractions were separated from the mitochondrial total lipid and quantified by thin-layer chromatography, and the fatty acid profile was obtained of each one by acid-catalysed transmethylation and gas-liquid chromatography. Fish CS functioning was measured by the study of locomotor activity rhythm. For that, individuals of different ages were placed in specifically designed chambers. These chambers were equipped by photoelectric cells which constantly register the fish activity and send the information to an informatics system. Temporal series data were obtained and analysed by a specific software for circadian rhythms as well as by analytic methods developed for this Doctoral Thesis. The two Nothobranchius species studied showed easily recognizable morphological changes, as colouration and body mass loss and spine curvature with age. At a biochemical level, fish showed highly unsaturated mitochondrial membranes, which is associated with high metabolic rate and oxidative stress, being characteristic of species that show explosive growth stages, like both species used. Highly unsaturated mitochondrial membranes are also related to a short lifespan, due to the high oxidation rate of mitochondrial molecules, mainly membrane lipids, which results in dysfunction and apoptosis. The mitochondrial membranes could be the pacemaker of a number of processes leading to a progressive and irreversible impairment which characterise the aging process. These processes affect animal physiological systems functionality and increase the individual fragility, showing the individual unable to respond to unexpected environmental stresses. Results from the present work show that Nothobranchius CS is strongly affected by age and its impairment could be one of the trigger factors of the last stages in the ageing process. This Doctoral Thesis shows the suitability of using Nothobranchius species as ageing models because of their characteristics as short lifespan, low-cost breeding and maintenance in the laboratory and by showing a progressive ageing easy to characterise and to extrapolate to humans. Also, these species have shown their potential to test the use of chronobiotic agents as melatonin, bringing us new possibilities to study, in the near future, possible treatments against ageing.
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Functional characterization of mast cells and histamine in the immune system of gilthead seabream (Sparus aurata L.) = Caracterización funcional de las células cebadas y de la histamina en el sistema inmunitario de dorada (Sparus aurata L.)
(2017-04-27) Gómez González, Nuria Esther; García Ayala, Alfonsa; Sepulcre Cortés, María Pilar; Escuela Internacional de Doctorado
El sistema inmunitario de peces teleósteos ha sido estudiado durante décadas y, a pesar de haberse realizado importantes avances en su conocimiento, todavía hoy existen grandes lagunas, especialmente sobre la presencia y la función de las células cebadas (MCs) y la histamina. La dorada (Sparus aurata L.), pez teleósteo marino de alto valor comercial en la acuicultura mediterránea, ha sido utilizado por numerosos autores en el estudio de la respuesta inmunitaria de peces. Además, y debido al hecho de que la dorada es una especie hermafrodita, muchos estudios se han centrado en el efecto que el estrógeno sintético 17α-etinilestradiol (EE2), ampliamente distribuido en los ambientes acuáticos, ejerce sobre ella. Sin embargo, ninguno de estos estudios se ha centrado en los leucocitos peritoneales. Con estos precedentes, el objetivo de esta tesis ha sido avanzar en el conocimiento del papel de las MCs y la histamina en la respuesta inmunitaria de la dorada. En el primer capítulo desarrollamos un protocolo de aislamiento de MCs peritoneales de dorada. Utilizando gradientes de centrifugación y densidad, cultivos celulares, separación celular activada por magnetismo y anticuerpos monoclonales específicos (mAb) se obtuvieron fracciones de MCs con un 95% de pureza. Las MCs peritoneales aisladas presentan histamina, la cual es liberada utilizando el compuesto 48/80 (Co 48/80), clásico activador de células cebadas. Además, la expresión de los genes il1b e il8 se induce en estas células tras estimularlas con ADN bacteriano. Este protocolo de aislamiento de MCs permitirá avanzar en el conocimiento de la evolución de los mecanismos inflamatorios de vertebrados. En el segundo capítulo, estudiamos el efecto de la histamina y del Co 48/80 en la respuesta inmunitaria innata y adaptativa de dorada. Para ello, inyectamos vía intraperitoneal histamina o Co 48/80, solos o combinados con el patógeno Vibrio anguillarum, y se analizó su efecto en el exudado peritoneal y en el riñón cefálico. La histamina y el Co 48/80 alteran el porcentaje de leucocitos peritoneales y de riñón cefálico, incrementan la producción de ROS y alteran la producción específica de IgM contra V. anguillarum. Además, ambos compuestos reducen la expresión del gen que cifra el receptor 2 de histamina en leucocitos peritoneales. Estos resultados demuestran que aunque la administración sistémica de histamina y Co 48/80 es segura, ninguno de los dos compuestos puede ser considerado como un adyuvante eficiente en la vacunación intraperitoneal de dorada. En el tercer capítulo, produjimos y caracterizamos un mAb, GB10, que reconoce específicamente MCs de dorada. GB10 marca el 20-30% de los leucocitos peritoneales. GB10 induce rápidamente la muerte de las MCs de dorada, como demostramos mediante citometría de flujo. Ensayos in vivo, en los que GB10 será intraperitonealmente inyectado en dorada, nos ayudarán a comprender aspectos evolutivos tanto de las MCs como de la histamina. Finalmente, en el cuarto capítulo, analizamos el efecto de EE2 en la respuesta inmunitaria peritoneal de dorada. El EE2 fue administrado en la dieta de juveniles de dorada durante 76 días que fueron inyectados intraperitonealmente con hemocianina y aluminio como adyuvante al final del tratamiento y 92 días después. La administración en dieta del EE2 induce la expresión de los genes que cifran los receptores de estrógenos, el nuclear α y el acoplado a la proteína G1. De manera interesante, la administración en dieta del EE2 indujo una respuesta inflamatoria en el exudado peritoneal que se mantuvo durante varios meses después de finalizar el tratamiento, además de modular la expresión de los genes que cifran los receptores de histamina. En conjunto, este estudio proporciona nueva información sobre la disrupción endocrina inmunitaria, centrada en los leucocitos peritoneales. The immune system of teleost fish has been studied for decades but, despite the important advances made in our related knowledge, much is still unknown, especially about the presence and role of mast cells (MCs) and histamine. The gilthead seabream (Sparus aurata L.), a marine teleost fish of great commercial value in the Mediterranean aquaculture, has been widely used for better understanding the fish immune response. Moreover, and due to the fact that the gilthead seabream is a hermaphrodite specie, many studies has focus on the effects that the synthetic estrogen 17α-ethinylestradiol (EE2), widespread in the aquatic environment, exerts in this specie. However, no studies have been focused on peritoneal leukocytes. Within the above framework, the aim of this thesis has been to advance our knowledge of the role of MCs and histamine in the immune response of the gilthead seabream. The first chapter ended up with the development of a protocol to isolate peritoneal MCs of gilthead seabream. Using discontinuous density gradient centrifugations, cell culture, magnetic-activated cell sorting, and specific monoclonal antibodies (mAb), 95% pure MC fractions were obtained. Isolated peritoneal MCs possess histamine which is released by the compound 48/80 (Co 48/80), the classical mast cell activator. Moreover, IL-1β and IL-8 gene expression was induced in these cells by stimulation with bacterial DNA. This MC isolation protocol will be useful in the knowledge advance of the vertebrate inflammatory mechanisms evolution. In the second chapter, we study the effect of histamine and Co 48/80 on the innate and adaptive immune response of gilthead seabream. For this purpose, histamine and Co 48/80 were intraperitoneally injected alone or combined with the pathogen, Vibrio anguillarum, and their effects on peritoneal exudate and head kidney were analyzed. Histamine and Co 48/80 alter the percentage of peritoneal exudate and head kidney immune cells, increase the ROS production by peritoneal leukocytes and impair the humoral adaptive immune response, i.e. production of specific IgM to V. anguillarum. Moreover, both, histamine and Co 48/80, reduce the expression of the gene encoding histamine receptor 2 in peritoneal leukocytes. These results show that although systemic administration of histamine and Co 48/80 is safe, neither histamine nor Co48/80 can be regarded as efficient adjuvants for gilthead seabream intraperitoneal vaccination. In the third chapter, we report the production and characterization of a mAb, GB10, which specifically recognizes gilthead seabream MCs. GB10 reacted with 20-30% of peritoneal leukocytes. GB10 rapidly induce death of gilthead seabream MCs, as demonstrated by flow cytometry. In vivo assays, in which GB10 will be intraperitoneally injected in gilthead seabream, will help to understand the evolutionary aspects of both MCs and histamine. Finally, in the fourth chapter, we analyze the effects of EE2 in the peritoneal immune response of gilthead seabream. Juvenile fish were fed a pellet diet supplemented with EE2 for 76 days and intraperitoneally injected with hemocyanin plus imject alum adjuvant at the end of EE2 treatment and 92 days later. The dietary intake of EE2 induces the expression of genes encoding for the nuclear estrogen receptor α and the G protein-coupled estrogen receptor 1 in the peritoneal leukocytes. Interestingly, the dietary intake of EE2 induced an inflammatory response in the peritoneal exudate, which was largely maintained for several months after the cessation of the treatment and, besides, modulates histamine receptor gene expression. Taken together, the study provides fresh information about endocrine immune disruption, focusing on peritoneal leukocytes.
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Incorporación de conservantes naturales en los piensos para peces:optimización de la calidad y vida útil de la dorada
(2014-11-24) Hernández Contreras, Ángel; Hernández Llorente, Mª Dolores; García García, Benjamín; Facultad de Biología
El objetivo principal que se planteó en la presente Tesis Doctoral fue estudiar la incorporación de conservantes naturales en el pienso de dorada, como estrategia para incrementar la estabilidad oxidativa del pienso y posiblemente la del pescado. El estudio del efecto protector de conservantes naturales en el pienso se llevó a cabo simulando las condiciones industriales tanto en la producción como en el almacén de piensos para peces. Se prepararon cinco piensos extruidos diferentes, un pienso basal o control, un pienso con un antioxidante sintético (butil-hidroxitolueno) y los tres restantes con extracto de romero, aceite esencial de tomillo -quimiotipo carvacrol- o aceite esencial de tomillo -quimiotipo timol-. Se almacenaron durante 24 semanas en refrigeración o a temperatura ambiente. Durante este periodo se midió la oxidación lipídica y la susceptibilidad a la misma (TBARS y TBARS-i). Para determinar la dosis óptima de conservantes naturales en la mejora de la calidad y la conservación de la dorada se realizaron dos experimentos de engorde con pienso con distintas dosis de aceite esencial de tomillo -quimiotipo timol- o de extracto de romero. Se analizaron parámetros de rendimiento y parámetros físico-químicos, microbiológicos y sensoriales de frescura. Además de esto, en el experimento con romero se analizó la histología del hígado y la bioquímica sanguínea, mientras que en el experimento con aceite esencial de tomillo se estudió la histología del intestino e índices biométricos. La adición de conservantes naturales al pienso demostró ser una buena alternativa a los conservantes sintéticos para protegerlo frente a la oxidación lipídica. La actividad antioxidante del romero fue similar a la del butil-hidroxitolueno durante el procesado del pienso y durante su almacén a temperatura ambiente y en refrigeración. Los aceites esenciales de tomillo (quimiotipo timol y quimiotipo carvacrol), aunque tienen una demostrada actividad antioxidante, no fueron capaces de equiparar al butil-hidroxitolueno durante el secado del pienso e incluso el timol mostró cierta actividad pro-oxidante. Durante el periodo de almacén los piensos se mantuvieron sin grandes cambios en cuanto a oxidación lipídica, validando estas condiciones de almacén durante el tiempo que suelen permanecer en la empresa de acuicultura. El uso de conservantes naturales provenientes de plantas aromáticas en el pienso mejoró propiedades sensoriales del pescado fresco como el olor, el color de las agallas y el índice de calidad. Los parámetros fisicoquímicos utilizados no mostraron grandes diferencias aunque la oxidación lipídica fue inferior en peces alimentados con dietas suplementadas con extracto de romero. El aceite esencial de tomillo -quimiotipo timol- y extracto de romero añadidos al pienso han demostrado un efecto beneficioso sobre la conservación del pescado. Ambos tuvieron un efecto dosis dependiente sobre parámetros fisicoquímicos del deterioro, siendo proporcional a la dosis en caso del tomillo y con una dosis óptima de 600 mg/kg en el caso del romero. La calidad sensorial siguió tendencias similares y en ambos casos se tradujo en un incremento de un día en la vida útil en términos sensoriales con cualquier dosis. Los aceites esenciales y extractos de plantas aromáticas también ejercen ciertos efectos en la fisiología de los peces modulando, entre otros aspectos, el metabolismo lipídico y la respuesta inmune. El extracto de romero fue capaz de modular el metabolismo lipídico, reduciendo la esteatosis hepática de los peces que se suele producir durante la alimentación con dietas de alta energía y mejorando parámetros de bioquímica sanguínea. El aceite esencial de tomillo produjo un aumento de la inflamación aparente en el intestino de dorada a dosis bajas y una reducción a dosis altas. En ambos casos se observó una respuesta bifásica, algo común en fitoquímicos añadidos a la dieta. The main objective that was raised in the present thesis was to study the incorporation of natural preservatives in the feed of gilthead seabream as a strategy to increase the oxidative stability of feed and possibly of fish. The study of the protective effect of natural preservatives in the feed was carried out simulating industrial conditions both in production and in the storing of fish feed. Five different extruded fish feed were prepared: a basal or control diet, a diet with a synthetic antioxidant (butylated hydroxytoluene) and the remaining three ones with rosemary extract, thyme essential oil -carvacrol chemotype-, or thyme essential oil-thymol chemotype-. Feed were stored for 24 weeks under refrigeration or at ambient temperature. During this period lipid oxidation and susceptibility to oxidation was measured (TBARS & i-TBARS). To determine the optimum dose of natural preservatives to improve the quality and conservation of githead seabream, two feeding trials was carried out with different doses of thyme essential oil (thymol chemotype) or rosemary extract. Performance, physical-chemical, microbiological and sensorial parameters were analysed. Additionally, liver histology and blood biochemistry were examined in rosemary extract experiment and gut histology and biometric indices in thyme essential oil experiment. The addition of natural preservatives to fish feed was proved to be a good alternative to synthetic preservatives to protect it against lipid oxidation. The antioxidant activity of rosemary was similar to that of butylated hydroxytoluene during the processing of feed and during storing both at room temperature and under refrigeration. Thyme essential oils (thymol and carvacrol chemotype chemotype), although they have a proven antioxidant activity, were unable to match the butylated hydroxytoluene during the drying of fish feed. Even the thymol showed some pro-oxidant activity. During the storage period, the feed remained mostly unchanged in terms of lipid oxidation, validating these conditions of storage during the time in which the feed typically stays in the fish farm. The use of natural preservatives from aromatic herbs in the feed improved sensory properties of fresh fish like the smell, the color of the gills and the quality index. The physicochemical parameters used did not show large differences; although lipid oxidation was lower in fish fed diets supplemented with rosemary extract. The thyme essential oil -thymol chemotype- and rosemary extract added to the feed have demonstrated a beneficial effect on the preservation of fish. Both have a dose-dependent effect on physicochemical parameters of spoilage, being proportional to the dose in thyme and with an optimum dose of 600 mg/kg for rosemary. In both cases resulted in a one-day increase of self-life at any dose. Essential oils and extracts of aromatic plants also have certain effects on fish physiology by modulating, among other aspects, lipid metabolism and immune response. Rosemary extract was able to modulate lipid metabolism, reducing hepatic steatosis, that often occurs during feeding high-energy diets, and improving blood chemistry parameters. Thyme essential oil produced an increased apparent swelling in gilthead seabream intestine at low doses and a reduction at high doses. In both cases a biphasic response was observed, as is common in phytochemicals added to the diet.
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Influencia de la luz y los patrones de alimentación sobre el reloj molecular, fisiología digestiva y comportamiento de dos peces teleósteos : lubina (Dicentrarchus labrax) y pez cebra (Danio rerio)= Influence of light and feeding patterns on the molecular clock, digestive physiology and behaviour of two teleost fishes: seabass (Dicentrarchus labrax) and zebrafish (Danio rerio).
(2013-06-13) Pozo Cano, Ana del; Sánchez Vázquez, Francisco Javier; Vera Andújar, Luisa María; Facultad de Biología
La luz y los patrones de alimentación influyeron sobre el comportamiento, fisiología y reloj molecular de dos peces teleósteos. Se clonaron dos criptocromos de lubina (cry1 y cry2), expresándose en todos los tejidos estudiados y mostrando ritmos diarios de expresión en cerebro, hígado y corazón (excepto cry2). La fase (día/noche) de alimentación a demanda en lubina afecta a los patrones diarios de actividad amilasa intestinal y expresión de period1 en tejidos periféricos (i.e. hígado), pero no en cerebro. Durante las inversiones estacionales de alimentación de la lubina, mostraron mayores valores de glucosa sanguínea durante la fase de alimentación, revelando también los mayores valores medios en lubinas nocturnas invierno. El pez cebra utilizó un nuevo comedero a demanda, mostrando independencia de fase entre ritmos circadianos de alimentación (nocturno) y locomoción (diurno), con diferentes periodicidades. Además la actividad y posición del pez cebra resultó espectro-dependiente, provocando mayores efectos las longitudes de onda cortas. Palabras clave: peces, peces teleósteos, pez cebra, lubina, Danio rerio, Dicentrarchus labrax, cronobiología, ritmos, zeitgeber, sincronizadores, luz, fotoperiodo, espectro, patrones de alimentación, comportamiento, fisiología, reloj molecular, genes reloj, cryptocromo, period, amilasa, glucosa.Thesis summary in English Light and feeding patterns influence on the behaviour, physiology and molecular clock of two teleost fish. Two cryptochromes (cry1 and cry2) were cloned, being expressed in all studied tissues and showing daily rhythm of expression in brain, liver and heart (except cry2). The self-seabass feeding phase (day/night) affected on daily patterns of intestinal amylase activity and on the period1 expression in peripheral tissues (i.e. liver), but not in brain. During the seasonal feeding inversions in seabass, the highest blood glucose levels were shown during their feeding phase, revealing also the highest values in nocturnal seabass in winter. Zebrafish used a new self-feeding system, displaying phase-independence between feeding (nocturnal) and locomotor (diurnal) circadian rhythms, with different periodicities. Moreover, the zebrafish activity and vertical position were spectrum-dependent, being the main effects provoked by short-wavelengths. Keywords: fish, teleost fish, zebrafish, seabass, Danio rerio, Dicentrarchus labrax, chronobiology, rhythms, zeitgeber, synchronizer, light, photoperiod, spectrum, feeding patterns, behaviour, physiology, molecular clock, clock genes, crytochromes, period, amylase, glucose.
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Inmunotoxicología producida por metales pesados y caracterización del moco de piel en peces= Heavy metal immunotoxicology and skin mucus in fish
(2014-09-02) Guardiola Abellán, Francisco Antonio; Esteban Abad, María Ángeles; Cuesta Peñafiel, Alberto; Meseguer Peñalver, José; Facultad de Biología
Durante la presente Tesis Doctoral se han estudiado los efectos inmunotoxicológicos de la exposición mediante baño a arsénico, cadmio y mercurio en la dorada (Sparus aurata L.), la cual es una especie que posee la mayor tasa de producción en la acuicultura mediterránea. Por otra parte, también se han estudiado los parámetros inmunológicos y físico-químicos del moco de la piel de cinco especies de peces teleósteos marinos. En el caso de la dorada los parámetros inmunológicos en el moco se compararon con los presentes en el suero. Por último, se evaluaron los efectos de estos metales pesados en la inmunidad de la mucosa de la piel de la dorada. Por otra parte, los peces ocupan una posición filogenética clave en la evolución de los vertebrados representando el primer grupo animal que tiene un sistema inmunitario innato y adaptativo bien estructurado, en este sentido, el estudio de la inmunología de este grupo de vertebrados tiene un doble interés científico y filogenético básico. En primer lugar, hemos evaluado los efectos de la exposición mediante baño a concentraciones sub-letales de arsénico (As), cadmio (Cd) y mercurio (Hg) en la dorada, con especial énfasis en la respuesta inmunitaria innata. En el caso del As, se observaron alteraciones histológicas en el hígado, así como acumulación de este metal en este órgano después de 30 días de exposición. Los parámetros inmunitarios humorales (niveles de IgM, actividades del complemento y la peroxidasa) no se vieron afectados, mientras que los parámetros innatos celulares del riñón cefálico (peroxidasa, explosión respiratoria y las actividades fagocíticas en los leucocitos) se incrementaron significativamente después de 10 días de exposición en comparación con los peces control. Del mismo modo, con respecto a la exposición a Cd, se observaron alteraciones morfológicas progresivas en el hígado y en el páncreas exocrino que se correlacionaron con la acumulación hepática de Cd, la reducción en la actividad del complemento en el suero y la explosión respiratoria en los leucocitos en un grado significativo después de 10 y 30 días de exposición. La actividad de la peroxidasa en el suero y la fagocitosis de los leucocitos aumentaron en diferentes momentos del muestreo, mientras que los niveles de IgM en el suero y la actividad de la peroxidasa en los leucocitos resultaron inalterados. Finalmente, se confirmaron los efectos toxicológicos del Hg porque los ejemplares de dorada expuestos mediante baño mostraron un aumento de las enzimas antioxidantes en el hígado después de 2 días, alteraciones histopatológicas en el hígado y la piel, así como la sobre-expresión de genes relacionados con el metabolismo de xenobióticos, el estrés celular y la apoptosis en la piel. Además, las actividades del complemento y la peroxidasa en el suero se incrementaron, así como la peroxidasa, la explosión respitaroria y las actividades fagocíticas en los leucocitos de riñón cefálico que se incrementaron en diferentes tiempos de exposición. En segundo lugar, se identificaron y caracterizaron los diferentes mecanismos de defensa humorales constitutivos de la mucosa de la piel de la dorada (Sparus aurata) y se compararon con los presentes en el suero. Por lo tanto, se demostró que el moco de la piel de la dorada contiene niveles más bajos de IgM, niveles similares de lisozima, fosfatasa alcalina y proteasas, y más altos en actividades como la esterasa, peroxidasa y antiproteasa que en el suero. Asimismo, el moco de la piel reveló una fuerte actividad bactericida contra bacterias patógenas de peces testadas en comparación con la actividad encontrada en el suero, mientras que las bacterias no patógenas pueden incluso crecer mejor en la presencia de moco. Además, se evaluaron los mecanismos de defensa humoral y parámetros físico-químicos en el moco de la piel de cinco especies de teleósteos marinos. Se observaron varias correlaciones entre los parámetros como el pH, la conductividad y el potencial redox, así como, entre la densidad y la osmolaridad. Centrándose en la respuesta inmunitaria, los resultados mostraron que mientras que algunas de las actividades inmunitarias fueron muy similares en los peces estudiados, otras, tales como las actividades de la proteasa, antiproteasa, fosfatasa alcalina, esterasa y peroxidasa variaron dependiendo de las especies de peces. Por último, se investigó si los parámetros de la inmunidad innata de las mucosas de la piel determinados en la dorada se ven afectados o no por los metales pesados ensayados anteriormente. De este modo, se detectaron algunos cambios en la composición del moco y en las funciones inmunitarias después de la exposición a estos metales. En general, el perfil de carbohidratos sufrió pequeñas variaciones y la mayoría de las actividades enzimáticas se incrementaron después de la exposición. Curiosamente, el Hg provocó los incrementos más importantes en la mucosa de la piel, mientras que los perfiles de proteínas obtenidos por SDS-PAGE y HPLC mostraron poca variación en el moco de la dorada después de la exposición a estos metales. En conclusión, estos resultados podrían ser útiles para una mejor comprensión de los efectos de la exposición a metales pesados en el sistema inmunitario de la dorada y como podrían afectar a la biología marina, la acuicultura o a los consumidores humanos. Por otra parte, el estudio de la función y el comportamiento de la inmunidad de las mucosas en la piel, como un componente clave del sistema inmunitario innato, podría ayudar a comprender la resistencia de los peces, así como la presencia y distribución de los patógenos y la magnitud de las infecciones y el uso de los parámetros como biomarcadores en la toxicología de los peces, los cuales serían los aspectos de mayor importancia para la acuicultura. During the present PhD Thesis, we have studied the immunotoxicological effects of waterborne exposure to arsenic, cadmium and mercury in the gilthead seabream (Sparus aurata L.), which is a species with the highest rate of production in Mediterranean aquaculture. Furthermore, the immunological and physico-chemical parameters of the skin mucus from five marine teleost fish species have been also studied. In the case of gilthead seabream the immunological parameters in mucus were compare with those present in serum. Finally, the effects of these heavy metals in the skin mucosal immunity of gilthead seabream were evaluated. Moreover, fish occupy a key phylogenetic position in the evolution of vertebrates representing the first animal group that has a well structured innate and adaptive immune system; in this sense, the study of the immunology of this group of vertebrates has a dual basic scientific and phylogenetic interest. Firstly, we have evaluated the effects of waterborne exposure to sub-lethal concentrations of arsenic (As), cadmium (Cd) and mercury (Hg) in the teleost fish gilthead seabream, with special emphasis in the innate immune response. In the case of As, we observed histological alterations in the liver as well as As-accumulation in this organ after 30 days of exposure. The humoral immune parameters (seric IgM, complement and peroxidase activities) were not affected while the cellular innate parameters of head-kidney (leucocyte peroxidase, respiratory burst and phagocytic activities) were significantly increased after 10 days of exposition compared to the control fish. Similarly, regarding Cd exposure, it was observed progressive deleterious morphological alterations in liver and exocrine pancreas that correlated with the hepatic Cd-accumulation, reduction in the serum complement activity and leucocyte respiratory burst to a significant extent after 10 and 30 days of exposure. The serum peroxidase activity and leucocyte phagocytosis were increased at different sampling times while serum IgM levels and leucocyte peroxidase activity resulted unaltered. Finally, toxicological effects were confirmed for Hg because waterborne-exposed seabream specimens showed increased liver antioxidant enzymes after 2 days, histopathological alterations in the liver and skin as well as up-regulation of the expression of genes related to xenobiotic metabolism, cellular stress and apoptosis in the skin. Further, serum complement and peroxidase activities were increased, as well as head-kidney leucocyte peroxidase, respiratory burst and phagocytic activities were increased in different exposure time. Secondly, different constitutive humoral defence mechanisms of the skin mucus of gilthead seabream (Sparus aurata) were identified and characterized and compared with those present in the serum. Thus, it was demonstrated that gilthead seabream skin mucus contains lower levels of IgM, similar levels of lysozyme, alkaline phosphatase and proteases, and higher esterase, peroxidase and antiprotease activities than serum. Skin mucus revealed stronger bactericidal activity against tested fish pathogen bacteria compared to the serum activity, whilst non-pathogen bacteria can even grow better in the presence of mucus. In addition, humoral defence mechanisms and physico-chemical parameters in the skin mucus of five species of teleosts were evaluated. Several correlations were observed between parameters as pH, conductivity and redox potential, as well as, density and osmolarity. Focusing on the immunological response, results showed that while some immune activities were very similar in the studied fish other such as protease, antiprotease, alkaline phosphatase, esterase and peroxidase activities varied depending on the fish species. Finally, we investigated whether the skin mucus innate immune parameters determined in the gilthead seabream are affected or not by the heavy metals assayed above. Thus, some changes in the mucus composition and immune functions after heavy metal exposure were detected. Overall, carbohydrate profile suffered little changes and most of the enzymatic activities were increased after exposition. Interestingly, Hg evoked the most important increments in the skin mucus and protein profiles obtained by SDS-PAGE and HPLC showed little variations in the seabream mucus after exposure to heavy metals. In conclusions, these results could be useful for better understanding the effects of exposition to heavy metals in the seabream immune system and as could interfere with fish biology, aquaculture management or human consumers. Moreover, the study of the role and behaviour of the mucosal immunity in skin, as a key component of the innate immune system, could help to understand the fish resistance as well as the presence and distribution of pathogens and magnitude of infections and use of parameters as biomarkers in fish toxicology, which would be aspects of major importance for the aquaculture industry.
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New insights into the skin and its mucus in teleost fish = Nuevas perspectivas en el estudio de la piel y el moco de peces teleósteos
(2017-01-18) Cordero Muñoz, Héctor; Esteban Abad, María Ángeles; Cuesta Peñafiel, Alberto; Facultad de Biología
En la presente Tesis Doctoral hemos estudiado la piel y el moco de teleósteos con especial énfasis en la inmunidad de dorada y de lubina. Concretamente, nos hemos centrado en la caracterización de la piel con diferenciación dorso-ventral, la respuesta inmune contra el principal virus en dorada (linfocistis), las condiciones óptimas de almacenamiento de moco para evaluar las actividades inmunes humorales, incluyendo la congelación (a -20ºC ó a -80ºC) y la liofilización, y comparando con moco fresco; así como también en la caracterización del mapa proteómico del moco de lubina y los cambios producidos por la administración del probiótico Shewanella putrefaciens Pdp11, el estrés por hacinamiento y las variaciones producidas por heridas crónicas. Para este propósito, hemos desarrollado estudios de histología para analizar las piel a nivel óptico (incluyendo tinciones con hematoxilina-eosina, PAS y tricrómico de Mallory), y a nivel electrónico cuantificando por análisis de imagen las regiones dorsal y ventral, desarrollando un protocolo para aislar células de la piel en ambas regiones, así como viendo el perfil de expresión génica de nueve citoquinas (il1b, tnfa, il6, il7, il8, il15, il18, il10 y tgfb) en ambas regiones y los cambios frente al patógeno Photobacterium damselae ssp. piscicida, y el probiótico Pdp11. En el brote natural de linfocistis, la replicación del virus se estudió la replicación del virus por PCR anillada, la respuesta humoral (IgM, complemento y peroxidasa en suero), la respuesta humoral contra el virus fue estudiada a través de los niveles de IgM, el complemento y la peroxidasa en suero, la respuesta celular a través peroxidasa y explosión respiratoria en leucocitos de riñón cefálico, y la expresión de marcadores inmunes como ifn, irf3, mx, mhc2a, csf1r, ighm, tcra, hamp, il1b y nccrp1. Para estudiar las variaciones en la inmunidad humoral debido al almacenamiento del moco hemos evaluado proteínas totales, unión de lectinas a azúcares terminales, IgM, peroxidasa, lisozima, proteasa, antiproteasa, esterasa y fosfatasa alcalina, que son las principales actividades humorales que se evalúan habitualmente bajo distintos retos. Para estudiar los proteomas, realizamos la purificación de las proteínas de moco, separación de estas proteínas en 2-D usando la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) e identificando esas proteínas luego a través de cromatografía líquida acoplada a espectrofotometría masas en tándem (LC-MS/MS). Finalmente, para el análisis bioinformático de los datos generados se utilizó el servidor MASCOT aprovechando las bases de datos de NCBI y SwissProt. En el caso de los proteomas diferenciales, se utilizó el programa PDQuest Advanced para detectar los spots diferencialmente expresados en los geles de dos dimensiones. Como resultados, en primer lugar la microscopía óptica y electrónica reveló una mayor superficie celular y área de microcrestas en la región dorsal, pero mayor grosor epidérmico y niveles de apoptosis en la región ventral. Además, el perfil de expresión de citoquinas no se alteró por la exposición al patógeno o al probiótico en la región dorsal pero se alteró fuertemente en la región ventral. Por otro lado, el linfocistis, cuya replicación fue demostrada solo en el grupo infectado, provocó un descenso de la inmunidad adaptiva, y un incremento de la inmunidad citotóxica innata en el lugar de la infección. Respecto al moco de dorada, el almacenamiento por congelación o por liofilización disminuyó los niveles de unión de lectinas a azúcares terminales, y la lisozima y la proteasa, demostrando que la liofilización es el método menos recomendado ya que alteró los niveles de la mayoría de los parámetros, excepto IgM, antiproteasa y esterasa. A nivel proteómico, establecimos el primer mapa proteómico de lubina, contribuyendo a establecer marcadores de bienestar, muchos de ellos asociados a la inmunidad de la mucosa, necesario para un mejor entendimiento de las propiedades del moco en peces. Finalmente, la administración de Pdp11 incrementó los niveles de varias proteínas relativas al inmunitario, mejorando la inmunidad de la mucosa; mientras que las proteínas identificadas en el moco después de heridas crónicas disminuyeron en los niveles en todos los casos, aumentando por tanto la susceptibilidad a infecciones. During the present Doctoral Thesis, we have studied the skin and its mucus with special emphasis on the immunity of gilthead seabream and European sea bass. Concretely, we have focused on the skin characterization with dorso-ventral differentiation, the immune response against the main virus in gilthead seabream (linfocistis), the optimal conditions of skin mucus storage to assess humoral immune activities, including freezing (at -20ºC and at -80ºC) and lyophilization and comparing with fresh mucus, as well as the proteome map of skin mucus from European sea bass and the changes in the skin mucus proteome of gilthead seabream due to probiotic Shewanella putrefaciens Pdp11 intake, crowding stress and the variations produced by chronic wounds. For this purpose, we have developed studies of histology to analyse the skin cells at optical level (including several stains such as haematoxylin-eosin, PAS or Mallory’s trichrome) and at electronic level, quantifying by image analysis the dorsal and ventral regions, developing a protocol to isolate the skin cells of both regions, as well as studying the expression profile of nine cytokines (il1b, tnfa, il6, il7, il8, il15, il18 and tgfb) in both regions and their changes produced by the pathogen Photobacterium damseale ssp. piscicida and the probiotic Pdp11. In the natural outbreak of lymphocystis, its replication was studied by nested PCR, the immune response against the virus was studied evaluating the humoral activities such as total IgM levels, complement and peroxidase in serum, and cellular activities such as respiratory burst and peroxidase in head-kidney leucocytes, and the gene expression of immune-related markers such as ifn, irf3, mx, mhc2a, csfr1, ighm, tcra, hamp, il1b and nccrp1. For studying the variations produced in the humoral immunity from the stored skin mucus, we have evaluated total protein levels, lectin-biding levels, total IgM levels, peroxidase, lysozyme, protease, antiprotease, esterase and alkaline phosphatase, all which are the most evaluated activities under different challenges. For studying the proteomes, we have purified the skin mucus proteins, separating the protein complex by isoelectric point and molecular mass through 2-D SDS-PAGE, and identifying the peptides by LC-MS/MS. Finally, the bioinformatic analysis was performed by MASCOT server using the NCBI and SwissProt databases. In the case differential proteomes, PDQuest Advanced software was used to detect the differentially expressed spots in the 2-D gels. As results, first optical and electron microscopic analysis revealed higher cell surface and area of microridges in the dorsal region, but higher epidermal thickness and apoptosis cell death in the ventral region. In addition, the cytokine expression profile was unaltered by the pathogen and the probiotic in the dorsal regions but greatly altered in the ventral region. On the other hand, lymphocystis, whose replication was exclusively demonstrated in the infected, provoked a decrease of adaptive immunity, mainly IgM levels in serum and the adaptive immune markers in skin and head-kidney, and an increase of cytotoxic innate immunity at the site of the infection. Regarding to skin mucus of gilthead seabream, the storage by freezing or by lyophilization decreased the lectin-binding levels, and the lysozyme and protease activity. Our study demonstrated that lyophilization is the less recommended storage method since only three activities were unaltered when compared to fresh mucus: IgM, antiprotease and esterase. At proteomic level, we have established the first proteome map of European sea bass, helping to establish the welfare markers, many of them associated with the mucosal immunity, needed to a better understanding of the fish skin mucus properties. Finally, Pdp11 intake increased the levels of several immune-related proteins, improving the mucosal immunity; whilst all the identified proteins were under-expressed after chronic wounds, increasing the susceptibility to any infection.
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El pez zebra (Danio rerio) como modelo de estudio in vivo del papel de la telomerasa en la hematopoyesis= The zebrafish (Danio rerio)as a model to stydy in vivo the role of telomerase in hematopoiesis
(2014-05-06) Alcaraz Pérez, Francisca; Cayuela Fuentes, María Luisa; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Facultad de Biología
- Objetivos. En el presente trabajo se han cumplido dos objetivos concretos: 1. Desarrollo de un nuevo sistema chivato basado en la luciferasa para el estudio de promotores tanto constitutivos como inducibles en el contexto de un organismo completo. 2. Estudio del papel extracurricular del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la hematopoyesis usando el pez cebra como modelo. - Metodología. Embriones de pez cebra han sido manipulados genéticamente mediante la microinyección de plásmidos, morfolinos y ARN (solos o en combinación) en el estadío de desarrollo de 1-8 células para recrear las distintas condiciones experimentales de estudio. Para el abordaje del primer objetivo, el estudio de la actividad promotora en el contexto de un organismo completo se ha llevado a cabo mediante la medida de luminiscencia. Para el cumplimiento del segundo objetivo, el recuento de los distintos tipos de células sanguíneas en las distintas condiciones experimentales se ha abordado mediante la tinción específica con TSA (neutrófilos) o con o-dianisidina (eritrocitos), o mediante el uso de distintas líneas de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en neutrófilos y en macrófagos. La funcionalidad de los neutrófilos se ha estudiado mediante ensayos de reclutamiento a una herida y de respuesta a una infección bacteriana. El estudio de la actividad telomerasa se ha realizado mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica, y la longitud de los telómeros se ha cuantificado mediante Q-FISH, que consiste en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, y también mediante hibridación in situ con sondas de ARN. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Para el desarrollo del primer objetivo se combinaron las ventajas que tiene el ensayo clásico de la doble luciferasa con las que tiene el pez cebra como modelo vertebrado para desarrollar una técnica que permita analizar la actividad promotora y la función génica en el contexto de un organismo completo. El resultado fue una técnica rápida y sensible que puede ser utilizada como una nueva herramienta para caracterizar in vivo la mínima región promotora de un gen, la respuesta de promotores inducibles ante distintos estímulos, la validación de construcciones genéticas y la función de un gen de interés. La técnica desarrollada resulta muy valiosa cuando se combina con las ventajas que ofrece el pez cebra para hacer escrutinios a gran escala basados en el fenotipo, convirtiéndose en un sistema muy prometedor para la identificación y la validación de fármacos o genes que, por ejemplo, reviertan el fenotipo. El desarrollo del segundo objetivo de esta tesis muestra varias evidencias que apoyan al pez cebra como modelo para estudiar el papel del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la disqueratosis congénita, que es una enfermedad hereditaria de envejecimiento prematuro, cuyos pacientes mueren principalmente debido al fallo de la médula ósea. En este modelo, la inhibición genética de TR resultó en la afectación de la mielopoyesis, a pesar de que el desarrollo de las células madre hematopoyéticas fue normal. Sorprendentemente, la neutropenia causada por la ausencia de TR fue independiente de la longitud telomérica y de la actividad telomerasa. El análisis genetico mostró que TR modula la decisión del destino mieloide/eritroide mediante el control de los niveles de los factores de transcripción mieloide y eritroide spi1 y gata1, respectivamente, mediante la estimulación de gcsf y mcsf. Este modelo de pez cebra deficiente en TR ilumina el papel extracurricular de TR, y podría establecer dianas terapéuticas para la disqueratosis congénita. The zebrafish (Danio rerio) as a model to study in vivo the role of telomerase in hematopoiesis - Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Development of a new luciferase-based reporter system for studying both constitutive and inducible promoters in the context of a whole organism. 2. Study the non-canonical role of the telomerase RNA component (TR) in hematopoiesis using the zebrafish. - Methodology. Zebrafish embryos were genetically modified by injecting plasmids, morpholinos and RNA (alone or in combination) whitin the 1- to 8-cell developmental stage to simulate the different experimental conditions. For approaching the first goal, the study of the promoter activity in the context of a whole organism was carried out by measurement of luminiscence. To addressing the second goal, the counting of the different blood cells in the different experimental conditions was carried out by specific staining with TSA (neutrophils) or o-dianisidine (erythrocytes), or by using different transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins in neutrophils or macrophages. The neutrophil functionality was studied by quantifying the recruitment to a wound and the response to a bacterial infection. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence and called Q-TRAP, and the telomere length was quantified by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH). The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR, and also by in situ hybridization with RNA probes. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. Firstly, we have adapted the classical dual luciferase reporter assay from cell lines to whole zebrafish embryos/larvae. The result is a rapid and sensitive technique that can be used as a new tool to characterize the minimum promoter region of a gene as well as the in vivo response of inducible promoters to different stimuli. We have illustrated the usefulness of this system for studying both constitutive and inducible promoters. This assay has several advantages compared with the classical in vitro (cell lines) and in vivo (transgenic mice) approaches. Among others, the assay allows a rapid and quantitative measurement of the effects of particular genes or drugs in a given promoter in the context of a whole organism and it can also be used in high throughput screening experiments. We have showed several evidences supporting the zebrafish as a new model to study the role of the telomerase RNA component (TR) in DC, which is an inherited premature disease whose patients usually die of bone marrow failure. In this model, genetic depletion of TR results in impaired myelopoiesis, despite normal development of hematopoietic stem cells (HSCs). Interestingly, the neutropenia caused by TR depletion is independent of telomere length and telomerase activity. Genetic analysis shows that TR modulates the myeloid-erythroid fate decision by controlling the levels of the master myeloid and erythroid transcription factors spi1 and gata1, respectively, through stimulation of gcsf and mcsf. This model of TR deficiency in the zebrafish illuminates the non-canonical roles of TR, and could establish therapeutic targets for DC.
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Ritmos biológicos y relojes moleculares en teleósteos : ontogenia y sincronización a los ciclos diarios de luz y alimentación
(2016-03-17) Sánchez Férez, José Antonio; Sánchez Vázquez, Francisco Javier; Madrid Pérez, Juan Antonio; Departamento de Fisiología
Objetivo: El objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido profundizar en el conocimiento del sistema circadiano de teleósteos. Para ello se han utilizado cuatro especies, una especie de interés en investigación básica, el pez cebra, y tres especies de interés en acuicultura, la lubina, la dorada y la trucha arcoíris. Metodología: A lo largo de diferentes experimentos, se estudió la influencia de las condiciones de iluminación y de disponibilidad de alimento sobre los distintos ritmos circadianos de teleósteos y sobre la expresión de los principales genes que forman parte de los relojes moleculares. Asimismo, se analizó a nivel molecular la maduración de los relojes moleculares de teleósteos durante las primeras etapas del desarrollo y la influencia de las condiciones lumínicas sobre la funcionalidad de dichas estructuras. Resultados y conclusiones: Los principales resultados y conclusiones obtenidas fueron: - El gen per1 de lubina ha sido clonado y secuenciado. La expresion de este gen mostró un patrón de expresión circadiano, con una acrofase o pico de expresión cercana al final de la noche. - En larvas del lubina, la expresión del gen reloj per1, comienza en etapas tempranas del desarrollo, adquiriendo un patrón circadiano robusto a partir del día 16 post-eclosión bajo un ciclo LD. - El inicio de un patrón rítmico en la expresión de per1 en larvas de lubina requiere de la presencia un ciclo luz/oscuridad durante el desarrollo, permaneciendo arrítmico bajo condiciones constantes de luz u oscuridad. La composición del espectral de la luz utilizada en el ciclo LD, también afecta al comienzo de la expresión rítmica de este gen. - El fotoperiodo afecta a la expresión de los genes reloj durante el desarrollo embrionario de la trucha arcoíris. Bajo un fotoperiodo 12L:12D, se detectó un patrón rítmico de expresión en los genes reloj (per1 y clock) a partir del día 8 post-fertilización, mientras que la expresión rítmica de aanat2 es detectable a partir del día 21. Por el contrario, bajo condiciones constantes de luz, la expresión de los genes reloj es alterada. - Los ritmos de expresión de genes reloj en trucha arcoíris, podrían iniciarse por fotorreceptores aún no identificados, ya que aparecen antes del desarrollo de los fotorreceptores clásicos (pineal y retina), y no se observan bajo condiciones constantes. - Los peces cebra sometidos a alimentación periódica muestran una actividad anticipatoria al alimento, que se manifiesta como un aumento de la actividad locomotora en las horas previas a la hora de alimentación. - En pez cebra, el oscilador sincronizado por el alimento parece localizarse fuera del cerebro. - La alimentación aleatoria afecta a los ritmos de comportamiento en dorada provocando un aumento de los niveles diarios de actividad locomotora, mientras que la alimentación periódica provoca un incremento de la actividad locomotora en la las horas previas a la hora de la alimentación (FAA), mostrando un nivel de actividad diaria total menor. - En Dorada, la alimentación periódica mejora el bienestar animal y el crecimiento. Cuando los animales no pueden predecir la llegada del alimento aumentan los niveles de indicadores de estrés, como el cortisol y glucosa plasmáticos. Además, esta situación afecta al crecimiento, al menos a corto plazo. Estos resultados contribuyen al avance del conocimiento sobre sistema circadiano de teleósteos y ponen de manifiesto la importancia de las condiciones ambientales para el correcto desarrollo y funcionamiento del sistema circadiano, así como la influencia de este sistema sobre la fisiología global del todo el organismo. SUMMARY Aims: The aim of this Doctoral Thesis is to improve our knowledge on the circadian system in teleosts. To this end, four species have been used: one species of interest in basic research, the zebrafish, and three species of interest in aquaculture, the bass, the sea bream and the rainbow trout. Methods: Throughout the different experiments, the influence of lighting conditions and food availability on the different circadian rhythms in teleosts, and on the expression of the principal genes which form part of the molecular clock, was studied. The maturation of the molecular clock in teleosts during the initial stages of development and the influence of lighting conditions on the functionality of said structures were also analysed. Results and conclusions: - The clock gene, per1, was cloned in sea bass. This gene showed a circadian pattern of expression, with an acrophase or peak expression near the end of the dark phase. - In European sea bass larvae, per1 expression starts in the early stages of development, showing a circadian pattern of expression from day 16 post— - In sea bass lavae, the photoperiod induces the start of a rhythmic pattern in per1 expression during development, remained arrhythmic under constant conditions of light and dark. The spectral composition of light used in the LD cycle, also affect the onset of rhythmic expression of this gene. - The photoperiod affects the expression of clock genes during the embryonic development of rainbow trout. Under a 12L: 12D photoperiod, the rhythmic expression of the clock genes (Per1 and clock) are detectable from day 8 post-fertilization (dpf), while aanat2 rhythmic expression is detectable from day 21dpf. By contrast, under LL, the expression of clock genes is altered, - In rainbow trout embryos, the rhythmic expression of per1 starts before the development of the classical photoreceptors (pineal and retina), and is not observed under LL, suggesting that this cycle could be initiated by other as yet unidentified photoreceptors. - Zebrafish subjected to periodic feeding showed Food Anticipatory Activity, which is manifested by an increase in the locomotor activity in the previous hours prior to meal time. - In zebrafish, the oscillator synchronized by food could be located outside the brain. - In sea bream, random feeding affects behavioural rhythms, increasing the locomotor activity levels. In contrast, periodic feeding induced an increase in locomotor activity in the hours prior to meal time (FAA). - In sea bream, scheduled feeding improves animal welfare. When the animals cannot predict the arrival of the food, the levels of stress indicators, such as cortisol and plasma glucose, are increased. ). In addition, periodic feeding improves growth in sea bream, at least in the short term. The results contribute to the advancement of scientific knowledge on the circadian system in teleosts and highlight the importance of environmental conditions for proper development and functioning of the circadian system, as well as the influence of this system on the overall physiology of the whole organism.
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The zebrafish (Danio rerio) : new model to study the role of telomerase in aging and regeneration = El pez cebra (Danio rerio): nuevo modelo para el estudio de la función de la telomersa en envejecimiento y regeneración
(2016-03-08) Anchelin Flageul, Monique; Cayuela Fuentes, María Luisa; Departamento de Biología Celular e Histología
- Objetivos. 1. Caracterización de la longitud telomérica y de la expresión y actividad de la telomerasa en el pez cebra (Danio rerio) a lo largo de su ciclo de vida. 2. Caracterización de la línea de pez cebra deficiente en la subunidad catalítica de la telomerasa (tert). 3. Estudio de la longitud telomérica y de la expresión y actividad de la telomerasa en el pez cebra (Danio rerio) durante el proceso de regeneración de la aleta caudal del pez cebra salvaje y del pez cebra tert-deficiente. - Metodología. Para el primer objetivo, se han utilizado peces cebra de tipo salvaje, de diferentes estirpes y edades. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, el estudio de la actividad telomerasa mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica. La longitud telomérica se ha cuantificado por técnicas diferentes: TRF que consiste en una hibridación con una sonda telomérica radioactiva, Q-FISH y Flow-FISH que consisten en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. Para el cumplimiento del segundo objetivo, se han utilizado los genotipos, tert+/+, tert+/- y tert-/-. Además de las técnicas antes citadas, se han realizado curvas de supervivencia y un estudio histológico sobre diferentes tejidos (Hematoxilina/Eosina, PAS y TUNEL). El estudio de la G2 mutante se ha llevado a cabo con curvas de supervivencia, ensayo de apoptosis por TUNEL, y Q-FISH en núcleos metafásicos. Para el tercer objetivo, con los mismos genotipos y a diferentes edades. Se ha realizado un ensayo de detección de los círculos de ADN telomérico, un ensayo de regeneración en adultos con inhibición de un gen utilizando un morfolino seguido de electroporación o en larvas con inhibición de un gen por inmersión. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Los resultados de esta tesis han demostrado la estrecha relación de la expresión de la telomerasa y la longitud de los telómeros durante la vida del pez, concluyendo que estos dos parámetros pueden ser utilizados como biomarcadores de envejecimiento en el pez cebra. La línea de pez cebra deficiente en telomerasa ha mostrado signos de envejecimiento prematuro, como curvatura de la columna, infertilidad y reducción de la vida media de la G1, apoyando al pez cebra como un modelo prometedor para estudiar el envejecimiento inducido por el telómero. Además, la G1 muestra activación de p53 en respuesta al desgaste telomerico, reproduce el fenómeno de anticipación genética, ligado al acortamiento telomérico observado en humanos con DC, debido a haploinsuficiencia de la telomerasa. La G2 muere en las primeras etapas de desarrollo y la restauración de la actividad telomerasa rescata la longitud de los telómeros y la supervivencia, indicando que la dosis de telomerasa es crucial. La inhibición genética de p53 rescata los efectos adversos de la perdidad de telómeros, indicando que los mecanismos moleculares están conservados desde peces hasta mamíferos. El estudio de regeneración demuestra que los genotipos tert+/+ y tert-/- regeneran después de una o varias escisiones, aunque la eficiencia de regeneración disminuye con el envejecimiento en ambos. La línea tert-/- regenera con un ratio de regeneración menor que tert+/+, y mantiene la longitud telomérica. ALT está implicado en el mantenimiento de los telómeros durante la regeneración de la aleta caudal en el pez mutante, y se necesitan más estudios para determinar el papel de la telomerasa y posiblemente de ALT en el pez cebra salvaje durante este proceso. - Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Characterization of telomere length, telomerase expression and activity in zebrafish (Danio rerio) throughout its life cycle. 2. Characterization of the tert-deficient zebrafish line. 3. Study of telomere length, telomerase expression and activity in zebrafish (Danio rerio) during the caudal fin regeneration process in wild-type and tert mutant - Methodology. For approaching the first goal, wild-type zebrafish from different strains and different ages have been used. The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence called Q-TRAP, and also analyzed quantitatively by TRAP. The telomere length was quantified using three different techniques: by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH and Flow-FISH) or by hybridization using a radioactive telomeric probe (TRF assay). To address the second goal, three zebrafish genotypes: tert+/+, tert+/- y tert-/- have been used. Besides the above techniques, survival curves to estimate the mean lifespan of the first generation (G1) of tert mutant line, and a histological study of different tissues (Hematoxylin / Eosin, PAS and TUNEL staining) have been performed. To study the tert mutant line G2: survival curves, apoptosis by TUNEL assay, and Q-FISH on metaphasic nucleus. To achieve the third objective, we have used all three genotypes at different ages. Telomere length was analyzed by Flow-FISH, and the detection of telomeric DNA circles by CCassay. A caudal fin regeneration assay on adult with gene inhibition using morpholino following by electroporation was performed and finally a caudal fin regeneration assay on larvae with gene inhibition by immersion. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. The results of this tesis have shown that the expression of telomerase and telomere length are closely related during the entire life cycle of the fish and that these two parameters can be used as biomarkers of aging in zebrafish. Telomerase-deficient zebrafish characterization have shown premature aging and reduced lifespan in the first generation, as occurs in humans and may be considered as a promising model to study telomere-driven aging. Interestingly, this mutant line reproduced the genetic anticipation phenomenon, related to telomere shortening, observed in humans with DC. The second-generation embryos died in early developmental stages, and restoration of telomerase activity rescued telomere length and survival, indicating that telomerase dosage is crucial. Genetic inhibition of p53 rescued the adverse effects of telomere loss, indicating that the molecular mechanisms induced by telomere shortening are conserved from fish to mammals. The regeneration study showed that all genotypes regenerated after single or successive amputations and that regeneration efficiency decreased with aging. Tert mutant line showed a lower regeneration rate than its wild-type counterpart, and maintained telomere length in the regenerative tissue. ALT mechanism is implicated in telomere maintenance during caudal fin regeneration in telomerase-deficient fish. Further studies are necessary to definitively elucidate the role of telomerase and the possible ALT implication in telomere maintenance during caudal fin regeneration in wild-type animals.