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    Advances in non-invasive biomarkers of health and welfare in swine
    (Universidad de Murcia, 2025-12-19) Ortín Bustillo, Alba; Martínez Subiela, Silvia; Muñoz Prieto, Alberto; Tvarijonaviciute, Asta; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
    La importancia de la saliva como fuente de biomarcadores para evaluar la salud y el bienestar ha crecido en los últimos años. Los objetivos del doctorado fueron: (1) la validación de nuevos métodos para medir biomarcadores en saliva porcina; (2) la evaluación del efecto de factores pre-analíticos en biomarcadores salivales seleccionados; (3) la evaluación de la respuesta de biomarcadores salivales seleccionados a patologías comunes y su tratamiento.Para ello, este doctorado se dividió en dos partes principales:La primera parte se centra en el desarrollo y la validación de nuevos ensayos para la medición de zinc, cobre, hierro y ferritina utilizando kits comerciales en un analizador bioquímico automatizado (Artículo no1), ITIH4 (también conocido como Pig-Map) mediante un kit ELISA comercial (Artículo no9), y haptoglobina, proteína C reactiva y S100A12 mediante tecnología AlphaLISA (Artículos no7 y no8). Estos nuevos ensayos mostraron una adecuada precisión, exactitud y alta sensibilidad para sus mediciones en saliva porcina y se aplicaron en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. El zinc y la ferritina mostraron una reducción significativa en sus niveles en cerdos no suplementados con hierro (Artículo no1). Los niveles de S100A12 aumentaron en la saliva de lechones con diarrea por Escherichia coli (Artículo no7) y también aumentaron los niveles de ITIH4 en cerdos con mordedura de cola (Artículo no9). Además, la haptoglobina y la proteína C reactiva aumentaron en la saliva de lechones con meningitis por Streptococcus suis y disminuyeron en lechones con respuesta adecuada al tratamiento (Artículo no8). Otros biomarcadores salivales relacionados con el estrés, el estado redox, la inflamación y el sistema inmunitario mostraron cambios en estas situaciones.La segunda parte aborda la evaluación del efecto de factores pre-analíticos en la determinación de biomarcadores salivales seleccionados. En esta parte se estudiaron cuatro aspectos principales:Se estudió la influencia de la edad, el sexo y algunos parámetros productivos en cerdos de engorde; Se encontró que la mayoría de los analitos salivales mostraron cambios con la edad y algunos con el género (Artículos no2 y no5).El efecto del muestreo a diferentes horas del día en la medición de biomarcadores salivales. Muchos de los analitos mostraron cambios entre las tomas, lo que resalta la importancia de considerar el horario de muestreo en la recolección de muestras de saliva en estudios experimentales y para la monitorización del estado de salud (Artículos no3 y no5).Los efectos de la contaminación por heces de corral y pienso en los biomarcadores salivales, y si los tratamientos de centrifugación, filtración y clarificación podrían revertir los efectos de estos contaminantes en la evaluación de biomarcadores. En este punto, se observaron diversos resultados para cada analito y, en términos generales, la centrifugación fue el tratamiento con los mejores resultados para la eliminación de contaminantes (Artículos no4 y no5).El material utilizado para el muestreo de saliva. Para ello, se compararon diferentes materiales de recolección para estudiar si podían afectar de forma diferente los niveles de biomarcadores salivales. El material utilizado para la recolección de saliva puede influir en el volumen de saliva obtenido y podría influir en algunos biomarcadores; por lo tanto, sería deseable utilizar el mismo tipo de material de recolección durante el mismo estudio (Artículo no6).En general, la tesis proporciona información sobre nuevos biomarcadores y ensayos que pueden aplicarse en saliva, los factores pre-analíticos que pueden generar variaciones en los resultados y sus posibles aplicaciones como biomarcadores de enfermedades. Se espera que contribuya a una mejor monitorización de la salud y el bienestar de los cerdos y al conocimiento para futuras aplicaciones en este campo
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    Advances in the serological diagnosis of "Toxoplasma gondii" and "Neospora caninum" infections in the field of animal health
    (Universidad de Murcia, 2022-07-05) Huertas López, Ana; Cerón Madrigal, José Joaquín; Martínez-Carrasco Pleite, Carlos; Álvarez García, Gema; Escuela Internacional de Doctorado
    Introducción: la toxoplasmosis y la neosporosis son dos enfermedades causadas por los parásitos apicomplejos Toxoplasma gondii y Neospora caninum, respectivamente, que están distribuidos globalmente. La toxoplasmosis es una zoonosis y una de las principales causas de fallo reproductivo en pequeños rumiantes, con el consiguiente elevado impacto económico. Neospora caninum no es un patógeno zoonótico, pero es una de las principales causas de aborto en bovinos y también se asocia a fallos reproductivos en rumiantes. En la actualidad, el diagnóstico de estas parasitosis se basa con frecuencia en métodos serológicos, que podrían mejorar mediante la aplicación de una técnica más sensible como la fluorometría en tiempo retardado (TRFIA). Material y métodos: esta tesis se compone de tres actividades: (1) una revisión sistemática y meta-análisis sobre el desarrollo de nuevos métodos serológicos para diagnosticar toxoplasmosis en humanos y animales, enfocada a la perspectiva One Health y a analizar críticamente el proceso de validación; (2) un estudio de la seroprevalencia y factores de riesgo asociados a la infección por T. gondii en perros y gatos de un área antropizada (Bangkok, Tailandia); y (3) el desarrollo y validación de nuevas TRFIAs para detectar anticuerpos anti-T. gondii en suero de gatos y cabras, y anti-N. caninum en suero y leche de ovejas. En gatos, se evaluaron varios antígenos recombinantes y quiméricos mediante esta técnica. La validación analítica se basó en la estimación de la precisión intra- e inter-ensayo, sensibilidad (Se) analítica, exactitud y la reactividad cruzada con patógenos filogenéticamente relacionados. La validación diagnóstica se realizó mediante la evaluación del potencial discriminatorio entre positivos y negativos de la técnica (test de Mann Whitney), un análisis ROC (para la determinación del punto de corte óptimo, sensibilidad, especificidad -Sp- y área bajo la curva), la concordancia (usando el valor kappa) y el coeficiente de correlación de Spearman. Resultados: hay una falta de aplicación del enfoque One Health en los estudios sobre diagnóstico serológico de toxoplasmosis, especialmente en aquellos realizados en humanos y por investigadores médicos. El proceso de validación de nuevos métodos es muy heterogéneo y con frecuencia solo se realiza una validación diagnóstica y no analítica. La seroprevalencia de T. gondii en gatos y perros de Bangkok fue de 18,7% y 7,9%, respectivamente. Se desarrolló una TRFIA para detectar anticuerpos anti-T. gondii en gatos, en la que el antígeno quimérico TgSAG1-GRA8 obtuvo un mejor rendimiento diagnóstico en comparación con otros antígenos. Además, se desarrolló una TRFIA basada en el mismo antígeno quimérico para detectar anticuerpos anti-T. gondii en cabras con excelentes resultados en la Se analítica, y Se y Sp en el análisis ROC. Sin embargo, la reactividad cruzada con anticuerpos anti-N. caninum limita el uso de esta técnica. Finalmente, se desarrolló y validó una TRFIA basada en el antígeno recombinante NcGRA7 para detectar anticuerpos anti-N. caninum en suero sanguíneo y leche entera de ovejas, con alto rendimiento analítico y diagnóstico. Discusión y conclusiones: esta tesis doctoral aporta información nueva y actualizada sobre el desarrollo de métodos serológicos para diagnosticar infección por T. gondii en animales y humanos, destacando la necesidad de aplicación del enfoque One Health y del seguimiento del proceso de validación recomendado por la OIE. La elevada seroprevalencia de T. gondii en gatos y perros de Bangkok debería ser considerada como un riesgo para la salud pública en esta área antropizada. La nueva TRFIA desarrollada en esta tesis mejora la Se de las técnicas actuales de detección de infecciones por T. gondii y N. caninum y ha sido adaptada a muestras no invasivas, aunque se deberían evaluar mediante TRFIA nuevos antígenos de T. gondii para evitar la reactividad cruzada con N. caninum.
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    Advances in the study of inflammation biomarkers in the saliva of pig
    (Universidad de Murcia, 2023-10-24) López Martínez, María José; Cerón Madrigal, José Joaquín; Martínez Subiela, Silvia; Escuela Internacional de Doctorado
    La sepsis es una condición grave y potencialmente mortal caracterizada por una respuesta inflamatoria sistémica desencadenada por un agente infeccioso que puede llevar finalmente a la disfunción orgánica e incluso a la muerte. Los biomarcadores pueden permitir una intervención más temprana y un mejor tratamiento de la sepsis, mejorando los resultados de salud y el bienestar de los pacientes, y reduciendo el desarrollo de resistencia a los antibióticos y las pérdidas económicas. En medicina humana, varios biomarcadores se utilizan rutinariamente para detectar infecciones bacterianas y guiar en el uso responsable de antibióticos, como la procalcitonina. En medicina veterinaria, a pesar de que las enfermedades inflamatorias e infecciosas generan muchos problemas de salud y pérdidas económicas en las granjas, este campo está poco explorado. Esta tesis de doctorado busca contribuir al campo del diagnóstico y la caracterización de la sepsis en cerdos profundizando y ampliando nuestra comprensión de los biomarcadores inflamatorios, su comportamiento y su relevancia en la sepsis en cerdos. Los objetivos específicos son los siguientes: • Objetivo 1: Investigación bibliográfica sobre la sepsis y los biomarcadores más comunes utilizados para diagnosticar y monitorearla en la medicina veterinaria. • Objetivo 2: Identificación de nuevos biomarcadores potenciales utilizando técnicas de proteómica. • Objetivo 3: Validación y medición de varios biomarcadores de inflamación, estrés oxidativo, bienestar y daño muscular, con posibles aplicaciones en la inflamación séptica y el estudio de sus posibles cambios en la sepsis y otras condiciones. • Objetivo 4: Desarrollo y validación de nuevos ensayos para diagnosticar sepsis: procalcitonina y presepsina. Para alcanzar estos objetivos, se utilizó la siguiente metodología: • Las muestras de cerdo se recolectaron principalmente de saliva, con esponjas de polipropileno; también se recolectó sangre mediante punción de la vena yugular. • Se realizaron análisis proteómicos de las muestras de cerdo utilizando técnicas basadas en gel y sin gel, incluyendo SDS-page y espectrometría de masas. • Se emplearon varios métodos como kits comerciales automatizados, ELISAs y ensayos quimioluminiscentes para analizar los biomarcadores estudiados, abarcando estrés, inflamación, estado redox y daño muscular. • Se desarrollaron anticuerpos policlonales y monoclonales para la detección de dos biomarcadores de sepsis, procalcitonina y presepsina. Los anticuerpos policlonales se generaron mediante la inmunización de un conejo y una cabra, mientras que los monoclonales se produjeron utilizando ratones como la especie elegida para la inmunización, con la posterior producción de hibridomas. • La tecnología utilizada para el desarrollo de los ensayos con los anticuerpos previamente mencionados fue AlphaLISA, que tiene diversas ventajas, como el uso mínimo de muestra y la ausencia de pasos de lavado. En resumen, esta investigación contribuyó al desarrollo de herramientas valiosas para el diagnóstico de infecciones y condiciones inflamatorias, con un enfoque integral que involucró la producción de anticuerpos, la recolección de muestras, el desarrollo de ensayos y el análisis de biomarcadores. Las conclusiones específicas de esta tesis de doctorado son: 1. Los biomarcadores con potencial en el diagnóstico y monitorización de la sepsis pueden clasificarse en tres categorías principales: (1) proteínas de fase aguda y citocinas, que han sido tradicionalmente utilizadas en medicina veterinaria para evaluar la inflamación; (2) PCT, PSE y otras proteínas más recientes que son más específicas de infecciones bacterianas; y (3) otros marcadores que pueden proporcionar información complementaria. 2. En los estudios proteómicos, la saliva y el suero mostraron patrones diferentes en respuesta a la inflamación séptica en un modelo inducido por LPS y la meningitis debida a Streptococcus suis. Además, se encontraron cambios en las proteínas de la saliva en otras enfermedades sépticas, como la diarrea causada por Escherichia coli. 3. La sepsis produce cambios en los analitos salivares relacionados con estrés, estado redox, inflamación y daño muscular, lo que abre la posibilidad de utilizarlos como posibles biomarcadores para este proceso en el cerdo. En esta línea, se requieren estudios adicionales para definir la capacidad y las aplicaciones de estos biomarcadores en el diagnóstico y monitorización de la sepsis, así como establecer valores de corte precisos. 4. La procalcitonina se midió por primera vez en la saliva porcina y mostró aumentos más elevados en cerdos con diferentes patologías sépticas, como en un modelo inducido por LPS, en meningitis por Streptococcus suis y en un brote de mordedura de cola; que en procesos inflamatorios no sépticos como un modelo inducido por trementina.
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    Análisis del estado de salud porcino en condiciones de campo mediante el uso de biomarcadores salivales
    (Universidad de Murcia, 2025-12-01) Sánchez Hernández, Jorge; Gutiérrez Montes, Ana María; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
    Esta Tesis Doctoral aporta una visión global en el análisis del estado de salud del ganado porcino en condiciones de campo mediante el uso de biomarcadores salivales. Mediante cuatro experimentales se buscaron tres objetivos: (i) aumentar el conocimiento de los biomarcadores salivales actuales, establecer sus intervalos de referencia y valorar nuevos biomarcadores (ii) comparar el poder diagnóstico de la saliva frente al suero para detectar enfermedad con la ventaja de usar una muestra no invasiva (iii) diferenciar distintas alteraciones de la homeostasis porcina mediante un panel de biomarcadores salivales. El objetivo 1 se explica en las experimentales 1 y 2 mediante el análisis de los factores que influencian los valores normales de animales sanos y la cuantificación, por primera vez, de elementos traza en muestras de saliva porcina como biomarcadores de salud. En la experimental 1 se evaluó la influencia de la raza, sexo y etapa de producción en los valores normales de los biomarcadores salivales proteína C reactiva (CRP), haptoglobina (Hp), adenosina desaminasa (ADA) y capacidad antioxidante total (TAC). Se utilizaron cerdos comerciales e ibéricos observándose diferencias en todos los marcadores estudiados. Los factores sexo y etapa de producción se analizaron por separado para cada raza, encontrándose también diferencias. Se podría concluir que la raza, el sexo y la etapa de producción influyen en los valores de los biomarcadores salivales del estado de salud en cerdos y deben tenerse en cuenta para establecer intervalos de referencia y poder realizar interpretaciones correctas en condiciones de campo. La experimental 2 cuantificó los elementos traza Cu, Zn, Se, Cd y Pb en saliva porcina mediante espectrometría de absorción atómica en animales con diversas patologías (cojeras, fatigas, prolapsos rectales o retraso en el crecimiento). Se estudió la posible asociación entre los valores de elementos traza y los biomarcadores salivales de estado de salud CRP, Hp, TAC y ADA encontrándose alteraciones en los niveles de dos o más elementos traza en los distintos grupos de cerdos enfermos, con variaciones según patología, por lo que la cuantificación salival de oligoelementos podría considerarse una herramienta complementaria para la detección y diferenciación de enfermedades. El segundo objetivo se explicó mediante la experimental 3, donde se comparó el poder diagnóstico de un conjunto de biomarcadores (CRP, Hp, ADA, TAC, Cu, Zn y proteínas totales) en muestras de saliva y suero. Los resultados mostraron que la saliva podría reemplazar al suero para la medición de proteínas de fase aguda. Para otros biomarcadores no hubo correlación, pero el análisis en saliva mostró una sensibilidad superior para detectar enfermedades que el suero. Además, la mejor combinación de biomarcadores en saliva (Hp, CRP, TAC y ADA) requiere menor tiempo, dinero y cantidad de muestra que la mejor combinación en suero (Hp, CRP y Cu). Asimismo, la distribución de biomarcadores analizados mostró una mayor diferencia entre animales sanos y enfermos cuando se utilizaron muestras de saliva. En resumen, la saliva podría considerarse una alternativa eficiente al suero para la detección de cerdos enfermos. El objetivo 3 se alcanza mediante la experimental 4, donde se analizó la asociación entre los biomarcadores salivales de estrés psicosocial (cortisol, alfa-amilasa) y oxidativo [(TAC, estado oxidante total (TOS) e índice de estrés oxidativo (OSI)] con la respuesta inmune innata (CRP, Hp) y adaptativa (ADA, Cu, Zn), realizando un primer intento de discriminar entre enfermedades (mordeduras de colas, prolapsos, diarreas, cojeras y disneas). Se encontró una asociación alta entre estrés oxidativo y sistema inmune adaptativo y moderada entre estrés psicosocial y sistema inmune. Cada condición patológica mostró diferencias en el grado de activación de los sistemas analizados, lo que podría utilizarse para crear diferentes perfiles y caracterizar enfermedades.
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    Aportaciones al tratamiento de diarreas crónicas inespecíficas en el perro : estudio del perfil farmacocinético de infliximab, tilosina y transferencia de microbiota fecal
    (Universidad de Murcia, 2022-11-11) Martínez Robles, Ignacio; Ayala de la Peña, Ignacio; Fernández Varón, Emilio; Escuela Internacional de Doctorado
    Para la realización del estudio mediante trasferencia de microbiota fecal, se utilizaron dos grupos siguiendo el mismo protocolo. Un grupo constituido por pacientes del Hospital Veterinario de la Universidad de Murcia: perros con enteropatías crónicas (más de 3 semanas de duración), diagnosticados de IBD a diferentes niveles (estomago, duodeno o colon principalmente) mediante biopsia endoscópica. Un segundo grupo constituido con pacientes de la clínica veterinaria para pequeñas especies Hinckley Vets4pets (Inglaterra): perros con diarrea crónica con respuesta parcial al tratamiento con antibióticos inicialmente tratados con metronidazol y que sufrieron recaída. En todos los casos, los dueños autorizaron la realización de uno o dos TMF y suministraron información sobre la evolución clínica del animal. Se llevo a cabo una clasificación por puntos de la enfermedad inflamatoria intestinal, siguiendo el “Canine Inflammatory Diease Activity Index” (índice CIBDAI descrito por Jergens et al. (2003)). Para la gradación de las heces, se usó el sistema de puntuación “Waltham® faeces scoring system”. Los trasplantes se realizaron, tras pasar 48h desde la administración de la tilosina, por medio de un enema, a dosis de 5 mL/kg, tras dejar descongelar el excremento a temperatura ambiente durante la noche previa a la administración. Tras la primera transferencia se realizaron otras dos con dos días de intervalo entre ellas. Tras la tercera se realizó la última clasificación de la consistencia fecal, observando si existe mejoría clínica. Se realizó a continuación un seguimiento telefónico con el dueño para seguir la evolución del animal y se citó, cuando al paciente cuando se consideró oportuno. En el estudio farmacocinético de la tilosina se utilizaron 5 perros, todos ellos sanos, machos castrados, de raza Beagle cuyos pesos oscilaban entre los 15’6 y 24 Kg. Los animales tenían entre 2 y 3 años de edad. El estudio fue de tipo cruzado en 2 fases, con intervalos entre cada fase de 15 días para asegurar la ausencia de interferencias entre cada uno de los estudios. El antibiótico mencionado se administró a dosis de 5 mg/kg en solución acuosa por vía intravenosa (IV) en la vena cefálica derecha, y por vía oral (PO) mediante la administración de la dosis en polvo pesada e individualizada en cápsulas. Las muestras de sangre (1 mL) se recogieron de la vena cefálica izquierda hasta las 24h desde la administración IV y hasta las 96 h desde la administración PO del fármaco. La determinación analítica de tilosina en las muestras de plasma se ha realizado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizando el método de Abu-Basha et al. (2012), ligeramente modificado. En el estudio farmacocinético del Infliximab se utilizaron 5 perros, a los que se administró mediante infusión intravenosa lenta, durante 1’5 horas, una dosis de 5 mg/kg, y se mantuvieron en condiciones de hospitalización, durante las primeras 24 horas para después volver a sus perreras de origen. Para evaluar la tolerancia de los perros a la dosis de infliximab administrada, se han realizado análisis sanguíneos, hematológicos y bioquímicos. La determinación analítica de infliximab en las muestras de suero se ha realizado utilizando el kit Promitor IFX© (Grifols, España), un método comercial validado de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). En el estudio farmacocinético de la tilosina y el infliximab, se ha realizado mediante análisis compartimental y no compartimental. Respecto a los resultados obtenidos con los TFM, el índice CIBDAI tuvo una mejora clínica, tras el trasplante, del 100% en ambos grupos. En el caso del índice Walthan, la mejora se produjo también en el 100%. Además, ninguno de los animales sufrió pérdida de peso después del tratamiento y, en el caso 2 del grupo 2, el paciente no solo recuperó su peso, sino que continuó incrementándolo posteriormente. Todos los animales mejoraron disminuyendo la frecuencia de las deposiciones antes y después de la TFM en el grupo 1, mientras que en el grupo 2 todos mejoraron excepto un caso. Otro de los parámetros que más información aportan sobre el éxito o no del TMF es la evolución de la consistencia de las heces. En nuestro estudio, los resultados han sido bastante positivos de forma que el 100% de los casos ha presentado un aumento de la consistencia de las mismas. La distribución de tilosina en perros se ajusta a un modelo bicompartimental tras la administración intravenosa de 5 mg/kg del fármaco. La semivida de la fase de disposición rápida (t½λ1) para tilosina, ha sido de 1.3 horas, y la de la fase de disposición lenta (t½λz) de 8.89 horas y se ha obtenido un valor de MRT de 10,07 horas. El Cl obtenido ha sido de 0,21 L/kg/h, el Vss adquiere un valor de 2,15 L/kg, en tanto que Vz alcanza un valor de 2,77 L/kg. Tras la administración de tilosina en formulación oral, se ha obtenido una Ka de 2,11 h-1 y una t½ka de 0,33 h. La biodisponibilidad obtenida ha sido del 13,25±1,5%. En cuanto al infliximab, tras su infusión IV, sus concentraciones plasmáticas se ajustan a un modelo monocompartimental. Su t½λz ha sido de 210 horas y su MRT de 331 horas. Cabe destacar que la elevada semivida obtenida, aunque menor que en humanos, permitiría pautas de dosificación largas de hasta 6 semanas en el caso de que se pueda tratar animales afectados de enfermedad inflamatoria intestinal. Su Cl ha sido de 0,0001 L/kg/h, el Vss adquiere un valor de 0,049 L/kg y el Vz alcanza un valor de 0,047 L/kg. Respecto a la tolerancia de los perros al infliximab, no se observó alteración en el hematocrito ni en el recuento de glóbulos rojos, lo que indica que no existe anemia y que la función de la médula ósea es normal. No se ha producido déficit de vitamina B ni de ácido fólico y no cabe esperar trastornos del hígado. Los niveles de leucocitos, segmentados, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos se mantienen en todo momento dentro de los límites admitidos como normales. En el caso de los parámetros bioquímicos ensayados, todos permanecen dentro de los rangos aceptados como normales durante toda la experiencia. En conclusión, el 100% de los animales con IBD tratados con TMF obtuvieron un beneficio clínico. El análisis de los parámetros farmacocinéticos para las dos vías ensayadas para tilosina indican una distribución amplia (Vz = 2.77 L/kg) y suficiente para el posible tratamiento de afecciones en perros con enfermedad inflamatoria intestinal. La permanencia del fármaco infliximab en el perro, tras su infusión IV, atendiendo a la semivida plasmática obtenida ha sido de 210 h (IV), puede permitir establecer unos regímenes de dosificación lo suficientemente amplios para el tratamiento de los procesos intestinales inflamatorios.
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    Avances en el estudio de biomarcadores en el líquido cefalorraquídeo canino y su relevancia en las meningoencefalitis de origen desconocido
    (Universidad de Murcia, 2023-07-13) Verdú Serrano, María Elena; García Martínez, Juan Diego; Escuela Internacional de Doctorado
    Antecedentes: Las enfermedades inflamatorias del SNC, en perros, son procesos difíciles de diagnosticar por la estructura de este órgano y por el bajo porcentaje de casos que se observan en la clínica. Las pruebas de imagen y el análisis del LCR son fundamentales para su diagnóstico. En perros con MOD, sólo es posible el diagnóstico definitivo de estos animales, de manera postmortem, ya que la RM y el análisis del LCR son incapaces de ofrecer un diagnóstico definitivo, ni de distinguir entre los distintos subtipos de MOD. Por este motivo se ha medido un panel de 26 parámetros (proteínas totales, creatinina, urea, calcio, fósforo, UIBC, hierro, ferritina, amilasa, CK, ALT, LDH, colesterol, triglicéridos, ALP, GGT, AST, glucosa, proteína C reactiva, haptoglobina, ADA, TIOL, CUPRA, TEA, ACHE y BCHE) en LCR, para buscar biomarcadores, que ayuden al diagnóstico precoz y a la distinción entre los subtipos, en los animales que padecen este tipo de patologías. Material y métodos: Los animales de este estudio se dividieron en: grupo control (grupo A), compuesto por animales con epilepsia idiopática y grupo problema, que se subdividió en: perros con MOD (grupo B) y perros con MOD tratados con glucocorticoides (grupo C). Se obtuvo una RM y análisis rutinario de LCR en todos ellos, descartándose las meningoencefalitis infecciosas en los animales que presentaban MOD. La medición de los parámetros en LCR se realizó mediante un analizador automático de bioquímica. Para realizar el estudio comparativo entre grupos (grupo control, grupo problema y grupo problema con corticoides) se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, seguido del test de Dunn para comparaciones múltiples. Resultados: Tras la medición de los 26 parámetros se observó que 19 pudieron ser detectados en LCR canino (proteínas totales, creatinina, urea, calcio, fósforo, ferritina, amilasa, colesterol, triglicéridos, LDH, AST, GGT, glucosa, CRP, ADA, CUPRA, TEA, ACHE y BCHE) mostrando algunos de ellos alteraciones estadísticamente significativas entre los grupos, mientras que en otros, no fue posible su medición (UIBC, hierro, CK, ALT, ALP, haptoglobina y TIOL). Discusión: La utilidad de biomarcadores para el diagnóstico precoz de enfermedades inflamatorias del SNC, es la tendencia en medicina humana. Estos biomarcadores no sólo se han utilizado para el diagnóstico precoz, sino también para ofrecer un pronóstico e incluso monitorizar la efectividad de determinados tratamientos. En el caso de las MOD, hasta ahora no hay estudios con una información relevante que pueda solventar el gran inconveniente de no obtener un diagnóstico definitivo de estas patologías, que no sea de manera postmortem. Ni que ayude a que el diagnóstico de los distintos subtipos de éstas deje de realizarse de manera presuntiva. La medición de un panel de analitos ha resultado de utilidad, al observarse valores diferentes en parámetros del LCR entre el grupo control y el grupo problema. Estos resultados podrían utilizarse como marcadores tempranos de esta patología, ayudando a la distinción entre los diferentes subtipos de MOD e incluso podrían ser de utilidad para el pronóstico de la enfermedad y el seguimiento de los animales que se encuentren bajo tratamiento. Conclusiones: Existen analitos en LCR que varían en perros con epilepsia idiopática y perros con MOD que podrían utilizarse como biomarcadores de estas patologías. Además, otros analitos son detectables en LCR canino, pero no varían en perros con epilepsia idiopática y perros con MOD. Finalmente, otros parámetros no se pudieron detectar en el LCR de los perros incluidos en este estudio y debería considerarse su medición utilizando técnicas analíticas más sensibles. La administración de glucocorticoides varía los resultados obtenidos en el LCR, hecho que debe considerarse para la correcta interpretación de estos analitos en perros tratados con estos fármacos.
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    Caracterización de la osteocondrosis carpometacarpiana en el toro de lidia (Bos taurus) : Estudio de factores predisponentes
    (Universidad de Murcia, 2021-01-04) Mas Soler, Alberto; Sanes Vargas, José Manuel; Pallarés Martínez, Francisco José; Seva Alcaraz, Juan; Escuela Internacional de Doctorado
    En esta tesis nos planteamos la caracterización de la osteocondrosis (OC) carpometacarpiana y el estudio de sus factores predisponentes en el toro de lidia. Para ello, se analizaron los miembros torácicos de 182 machos bovinos de raza de lidia, lidiados en plazas de toros, y 39 machos bovinos de aptitud cárnica. Se determinó el grado de OC y el de caída. Se realizó un estudio de la OC mediante radiografía, tomografía y artroscopia. Y se estudió la bioestática del miembro torácico. La prevalencia de la OC en el toro de lidia fue del 92,31% y en el bovino de aptitud cárnica del 97,4%. Las lesiones se localizaron de forma bilateral (93,41%) y simétrica (65,93%), con mayor incidencia en el miembro izquierdo, y siempre en el aspecto articular medial de los huesos metacarpiano III y IV, coincidiendo con la zona de mayor estrés biomecánico. Las lesiones se clasificaron en grado I (25,27%), grado II (32,9%) y grado III (34,07%). En el toro de lidia se presentó apoyo valgus en mayor o menor medida. El peso y el encaste fueron factores que influyeron en la aparición de OC. Por último, el grado de caída aumentó con el porcentaje de lesión de OC.
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    Cell-mediated citotoxicity of fish leucocytes against betanodavirus
    (Universidad de Murcia, 2024-10-21) García Álvarez, Miguel Ángel; Chaves Pozo, Elena; Esteban Abad, María Ángeles; Cuesta Peñafiel, Alberto; Escuela Internacional de Doctorado
    Los peces criados en piscifactorías están sometidos a gran estrés, afectando a su sistema inmune y haciéndolos vulnerables a enfermedades. Entre los patógenos más letales se encuentran los virus, destacando el virus de la Necrosis Nerviosa Viral (NNV), causante de la enfermedad de la encefalopatía y retinopatía viral (VER). En el Mar Mediterráneo tiene prevalencia principalmente el genotipo RGNNV, siendo capaz de infectar a la lubina y a la dorada, siendo esta última resistente a VER. Sin embargo, la aparición de genotipos recombinantes (RGNNV/SJNNV y SJNNV/RGNNV) demostró que la dorada era capaz de desarrollar la enfermedad. Entre los mecanismos que presentan los peces teleósteos contra infecciones virales, destaca la citotoxicidad mediada por células (CMC), llevadas a cabos por diferentes tipos celulares, destacando las células citotóxicas no específicas (NCCs) y células semejantes a natural killer (NK-like) en el sistema innato mientras que en sistema adaptativo es llevado a cabo por linfocitos T citotóxicos (CTLs). La dorada es capaz de montar una respuesta innata efectiva contra NNV, destacado por su CMC innata, capaz de eliminar las células infectadas, mientras que en lubinas no. Por ello, el objetivo de esta Tesis Doctoral es profundizar en la dinámica de la respuesta citotóxica mediada por leucocitos de lubina y dorada frente a NNV. Para ello, en el Capítulo I se estudió se estudió la interacción de los genotipos recombinantes de NNV en larvas de dorada de diferentes edades, evaluando la mortalidad y genes implicados en las infecciones. Los resultados mostraron que ambos genotipos podían infectar larvas de diferentes edades, con mayor patogenicidad en larvas más jóvenes. El genotipo RGNNV/SJNNV produjo mayor mortalidad debido a la alta prevalencia viral y menor activación del sistema inmune. En el Capítulo II Se caracterizó el receptor CRTAM (presente en linfocitos T de mamíferos) y su ligando CADM1 en ambas especies mediante análisis bioinformático y se evaluaron sus expresiones génicas en diferentes condiciones, incluyendo una infección por NNV. El análisis identificó un gen de crtam y dos genes de cadm1 (cadm1a y cadm1b) en ambas especies. El gen crtam se expresó principalmente en tejidos inmunes, mientras que cadm1a y cadm1b se expresaron mayormente en cerebro y piel. En lubina, crtam parece expresarse en linfocitos T y participar en la infección por NNV, mientras que en dorada se expresa en NCCs o NK-like. El Capítulo III se centra en la identificación de la perforina en lubina mediante análisis bioinformático y en el estudio de su expresión génica en diferentes condiciones, así como en una infección por NNV, además de evaluar la presencia de células productoras de perforina mediante inmunohistoquímica en una infección por NNV. Se encontraron cuatro genes diferentes de perforina, prf1.2, prf1.3, prf1.5 y prf1.9, presentando todos ellos una expresión basal en diferentes tejidos y sintetizados principalmente por linfocitos T, excepto prf1.3. Además, todos los genes, excepto prf1.3, participaron en la infección contra NNV, apoyado por la generación de células productoras de PRF1.9 en cerebro, riñón cefálico y gónada. Por último, en el Capítulo IV se evaluó la CMC adaptativa usando como células efectoras leucocitos de lubinas infectadas por NNV y como línea diana células DLB-1 (provenientes de cerebro de lubina). La citotoxicidad innata no aumentó durante la infección, pero la citotoxicidad de leucocitos de peces infectados sí aumentó en fases tardías de la infección, indicando la activación del sistema inmune adaptativo. Este aumento fue específico contra los genotipos que compartían la misma cápside viral, apoyado por una posible restricción por MHC-I. En esta citotoxicidad adaptativa, se observó un aumento en las rutas de perforina/granzima y Fas/FasL, características de los CTLs, así como un aumento de la apoptosis.
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    Estudio epidemiológico de las parasitosis en animales silvestres de ambientes antropizados de México
    (Universidad de Murcia, 2021-01-14) Muñoz García, Claudia Irais; Berriatua Fernández de Larrea, Eduardo; Martínez-Carrasco Pleite, Carlos; Escuela Internacional de Doctorado
    El 60-70% de la biodiversidad de todo el planeta se concentra en 17 países megadiversos, uno de ellos es México. En estos países existe una falta de datos específicos sobre su biodiversidad y hay una acelerada pérdida de especies debido a la alteración de sus ecosistemas, lo que ha favorecido la emergencia de enfermedades desde la fauna silvestre, debido principalmente al incremento de las tasas de contacto entre humanos y animales domésticos con los animales silvestres. Es así que estos países son de especial interés de vigilancia epidemiológica, en donde es imperativo ampliar el conocimiento de los patógenos, incluidos los parásitos, y sus hospedadores silvestres. La generación de conocimiento en países megadiversos es una base necesaria sobre la que ha de sustentarse no solo la adecuada conservación de sus ecosistemas, sino también una gestión sanitaria eficaz que permita el control y la prevención de las enfermedades emergentes y re-emergentes. La presente tesis doctoral tuvo como objetivos recopilar la información existente sobre los parásitos y enfermedades parasitarias registradas en la fauna silvestre de México, estudiar un caso de infección severa por el nematodo Pelecitus spp. en el ave rapaz Caracara cheriway y realizar dos estudios epidemiológicos sobre la infección por el protozoo Leishmania spp. en animales Pilosa (perezosos y hormigueros) y la infestación de garrapatas duras en hormigueros de la familia Myrmecophagidae. Como resultado de la recopilación bibliográfica, hemos evidenciado que el estado actual del conocimiento de parásitos en la fauna silvestre de México es escaso y heterogéneo, porque está limitado a ciertas regiones, grupos parasitarios y especies hospedadoras. Los grupos parasitarios y hospedadores más estudiados son los helmintos en peces y los ectoparásitos en mamíferos, y los menos son los protozoos. Por otra parte, las recopilaciones bibliográficas sobre el protozoo Leishmania spp. en mamíferos del orden Pilosa permitió inferir que únicamente el perezoso Choloepus hoffmanni puede considerarse reservorio del parásito, capaz de transmitir la infección al vector. Con respecto a los registros existentes de garrapatas Ixodidae en hormigueros de la familia Myrmecophagidae, las del género Amblyomma son las más comunes, muchas de las cuales pueden ser vectores de bacterias Rickettsiales. La descripción de la infección por Pelecitus en el hospedador carancho norteño es la primera realizada en México y destaca la gravedad de la infección y además, según demuestra la bibliografía, su potencial zoonósico y facilidad para saltar la barrera de especie. La investigación epidemiológica de Leishmaniosis revela por primera vez la infección por L. mexicana-amazonensis en el hormiguero norteño, en uno de 16 (6,3%) animales analizados y se señala la necesidad de estudiar su potencial de reservorio de este parásito. En el estudio de la infestación por garrapatas en hormigueros norteños se identificaron cuatro especies del género Amblyomma y Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.), viéndose afectados 10 de los 23 (43%) individuos examinados. Así mismo, se describe por primera vez la infestación por A. auricularium y R. sanguineus s.l. en este hospedador en México. Se puede concluir que las investigaciones realizadas en esta tesis doctoral evidencian importantes lagunas en el conocimiento sobre las enfermedades parasitarias y urge a continuar con la investigación de las parasitosis en animales silvestres de países megadiversos. Esto facilitaría la toma de decisiones para mejorar la conservación de su biodiversidad y prevenir la aparición de enfermedades emergentes. En este sentido, el trabajo ahonda también en los problemas asociados a la antropización del medio natural como el de los atropellamientos de la fauna silvestre y el del comercio ilegal de especies, y destaca la importancia de los centros de recuperación de fauna silvestre en la conservación de especies y en la vigilancia de enfermedades.
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    Identificación de biomarcadores de úlcera gástrica en caballos
    (Universidad de Murcia, 2025-12-22) Matas Quintanilla, Marta; Gutiérrez Montes, Ana María; Rodolfo Ipharraguerre, Ignacio; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
    Dada la elevada prevalencia del síndrome de úlcera gástrica equina (EGUS), los múltiples factores de riesgo implicados, la inespecificidad de sus signos clínicos y la complejidad diagnóstica de la gastroscopia, que constituye el único método diagnóstico antemortem aceptado y fiable, en esta tesis doctoral se planteó la identificación y validación de biomarcadores en fluidos biológicos mínimamente invasivos, que pudieran contribuir a la detección, cribado y monitorización de la enfermedad.En esta tesis doctoral se llevaron a cabo tres experimentos: 1) Identificación y validación de biomarcadores de úlceras gástricas en muestras de suero y saliva de caballos mediante técnicas proteómicas en gel; 2) Obtención de métodos cuantitativos apropiados para medir biomarcadores que faciliten la detección de úlceras gástricas en caballos; y 3) Evaluación del comportamiento de los biomarcadores de úlceras gástricas en caballos en condiciones clínicas. En dichos experimentos se trabajó con tres grupos de caballos. El primero estuvo constituido por ocho caballos sanos a los que se les indujeron úlceras gástricas experimentales. El segundo grupo incluyó veinte caballos de alta competición clínicamente sanos y veintiocho caballos con signos clínicos compatibles con úlceras gástricas y lesiones confirmadas mediante gastroscopia. El tercer grupo estuvo formado por caballos con lesiones ulcerativas en la mucosa gástrica, tanto con signos clínicos (n=28) como sin ellos (n=28), junto con un grupo control adicional de veintidós caballos clínicamente sanos y sin lesiones en la gastroscopia.En el Experimento 1, de carácter experimental, se trabajó con los ocho caballos a los que se les indujeron las úlceras gástricas mediante privación de alimento. Usando técnicas proteómicas (2DE y LC-MS/MS), se identificaron quince proteínas en saliva y cinco en suero con diferencias significativas entre los animales antes y después de la inducción de las úlceras. De esas proteínas, se validaron nueve en saliva (IL1-F5, IL1-F6, PIP, FABP5, CA-VI, albúmina, Apo A-4, ###1-antitripsina y serotransferrina), y las tres últimas también en suero, mediante SDS-PAGE y Western blotting.Posteriormente, en el Experimento 2, cinco de estos biomarcadores fueron cuantificados en saliva (IL1-F5, PIP, CA-VI, albúmina y serotransferrina), junto con dos marcadores de inflamación (ADA y S100A12). Los ensayos desarrollados presentaron precisión, exactitud y sensibilidad adecuadas, de acuerdo con las guías generales. En el Experimento 3, se evaluó el comportamiento de los siete biomarcadores bajo distintos escenarios clínicos y se estudió su valor diagnóstico. Los animales con úlceras mostraron concentraciones más altas que los animales sanos, con variaciones relacionadas con el tipo de lesión y la presencia de signos clínicos. El análisis de sus curvas ROC arrojó valores de AUC entre 0,80 y 0,84, para seis de los biomarcadores evaluados (IL1-F5, CA-VI, serotransferrina, albúmina, ADA y S100A12), lo que sugiere tener potencial clínico real como herramientas complementarias a la gastroscopia para la identificación temprana de EGUS. Únicamente PIP presentó un rendimiento limitado como marcador individual.Los resultados confirman que la saliva es un fluido biológico idóneo para la evaluación de biomarcadores asociados al EGUS, ya que permite una recogida rápida, sencilla y no invasiva. Se aporta, por primera vez, un conjunto validado de biomarcadores y métodos cuantitativos aplicables en la práctica clínica, lo que sienta las bases para el desarrollo de paneles multibiomarcadores que complementen la gastroscopia, actualmente el único método diagnóstico antemortem aceptado. Los biomarcadores evaluados abarcan diversas vías fisiopatológicas implicadas en el EGUS, incluyendo la respuesta inmune, la inflamación sistémica, la protección de la mucosa gástrica y el daño tisular, lo que refuerza su relevancia biológica. En conjunto, estos hallazgos respaldan su potencial para mejorar la detección temprana, la monitorización evolutiva y la toma de decisiones clínicas, contribuyendo a una gestión más eficaz y al bienestar de los caballos afectados.
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    Influencia de la penicilina y de las hormonas sexuales 17 beta-estradiol y progesterona sobre la infección por Chlamydia abortus en líneas celulares de endometrio y trofoblasto de origen ovino
    (Universidad de Murcia, 2018-12-07) Álvarez Sánchez, Daniel; Salinas Lorente, Jesús; Caro Vergara, María Rosa; Escuela Internacional de Doctorado
    Chlamydia abortus es un patógeno intracelular obligado que causa abortos al final de la gestación en pequeños rumiantes. En ovejas no gestantes, el microorganismo puede establecer una infección latente o subclínica hasta que se produce la gestación, momento en el cual se reactiva, invade la placenta y produce el aborto. Los mecanismos concretos que desencadenan la reactivación de C. abortus no se conocen en la actualidad. Estudios previos sugieren que las fluctuaciones de las hormonas que regulan los ciclos reproductivos en ovejas, en concreto el estradiol (E2) y la progesterona (P4) pueden estar asociadas con la reactivación de C. abortus. Sin embargo, esta asociación no se ha estudiado hasta ahora. Los objetivos de esta tesis son: (i) evaluar la influencia de la penicilina y del E2 y la P4 en el crecimiento de C. abortus in vitro; (ii) analizar la ultraestructura de inclusiones clamidiales desarrolladas en distintas líneas celulares y expuestas a penicilina, E2 o P4, y (iii) estudiar cambios en la respuesta transcripcional de C. abortus cultivada en distintas líneas celulares y expuesta a penicilina, E2 o P4. Los experimentos se llevaron a cabo sobre dos líneas celulares de origen ovino: la línea AH-1, procedente de trofoblasto y la línea LE, de epitelio endometrial. Los cultivos fueron tratados con penicilina, E2 o P4 antes de ser infectados con C. abortus. Utilizamos técnicas de inmunofluorescencia indirecta para determinar el número, tamaño y forma de las inclusiones intracitoplasmáticas en los distintos cultivos; además, realizamos aislamiento de cuerpos elementales a partir de los sobrenadantes de los cultivos, y finalmente se recogieron las células infectadas de cada cultivo para determinar la cantidad de ADN clamidial por q-PCR. Para evaluar el efecto de la penicilina y las hormonas en la ultraestructura de las inclusiones se recogieron pellets celulares a las 72 horas post-infección (hpi) y se observaron por MET. Los cambios transcripcionales de C. abortus ante los tratamientos fueron estudiados a partir del ARNm de células infectadas y recogidas a las 48 y 72 hpi. Se analizaron 16 genes relacionados con el ciclo de desarrollo clamidial mediante q-PCR. En general, las hormonas sexuales E2 y P4 aumentaron la infectividad de las células AH-1 y LE, mientras que la penicilina produjo el efecto contrario. Los cultivos de C. abortus tratados con penicilina mostraron, por primera vez en esta especie, características típicas del estado de persistencia como la aparición de inclusiones de pequeño tamaño que contenían cuerpos reticulares anormalmente grandes y un perfil de genes caracterizado por una regulación al alza de genes relacionados con la respuesta a estrés y una regulación a la baja de genes relacionados con la síntesis de proteínas de membrana y división celular, en ambas líneas celulares y momentos post-infección estudiados. Los genes omcA y omcB (proteínas de membrana), dnaK (respuesta a estrés) y hctA (conversión de CR a CE) se proponen como indicadores del estado de persistencia in vitro inducido por penicilina en Chlamydia abortus. Por otra parte, la suplementación del medio con hormonas produjo diferentes resultados en función de la línea celular utilizada, lo que sugiere que los efectos de las hormonas en el desarrollo del ciclo clamidial se producen de forma indirecta, a través de alteraciones en el ambiente de la célula hospedadora. Además, la progesterona y, en menor medida el 17β-estradiol, indujeron la aparición de formas aberrantes en cultivos de células LE, aunque este hecho no se asoció con alteraciones en los genes estudiados en Chlamydia abortus. Por tanto, no su pudo establecer un patrón común de expresión de genes que sea válido para distintos sistemas de inducción de persistencia clamidial. Chlamydia abortus is an obligate intracellular pathogen with affinity for placental tissues that causes reproductive failure in sheep and goats worldwide. In non-pregnant sheep, the organism can establish a latent or sub-clinical infection until the subsequent gestation, when it reactivates, invades the placenta and induces abortion. The precise mechanisms that trigger the awakening of C. abortus are still unknown. Previous studies suggest that fluctuations in hormones that regulate reproductive cycles in sheep, especially estradiol (E2) and progesterone (P4), might be associated with the reactivation of C. abortus. However, this association is poorly understood. The objectives of this PhD thesis are therefore: (i) to assess the influence of penicillin, E2 and P4 on the growth of C. abortus in vitro; (ii) to analyse the morphology of chlamydial inclusions grown in different cell lines and exposed to E2, P4 or penicillin, and (iii) to examine changes in the transcriptional response of C. abortus cultured in different cell lines and exposed to E2, P4 or penicillin. Experiments were carried out using two ovine cell lines: the trophoblast cell line AH-1 and the endometrial cell line LE. Cells were exposed to E2, P4 or penicillin prior to experimental infection with C. abortus. To study the influence of hormones and penicillin on the growth and development of C. abortus, we first performed an indirect immunofluorescence technique to assess the number and shape of inclusions in the different cultures. Then, we used supernatants to carry out the isolation and counting of viable free elementary bodies. Finally we collected cell monolayers to determine the amount of chlamydial DNA by q-PCR. To assess the effect of hormones and penicillin on the ultrastructure of inclusions, cell pellets were collected at 72 hours post-infection (hpi) and examined by transmission electron microscopy (TEM). Chlamydial transcriptional changes were studied from infected cells harvested at 48 and 72 hpi. mRNA expression analysis of 16 genes related to the chlamydial developmental cycle was carried out by q-PCR. Overall, sex hormones E2 and P4 enhanced the infectivity of AH-1 and LE cells, while penicillin had the opposite effect. Penicillin-treated C. abortus cultures showed, for the first time in this species, characteristic features of persistent infection such as appearance of small inclusions containing enlarged aberrant reticular bodies, and a gene profile characterised by general up-regulation of genes related to stress response and a down-regulation of genes related to membrane protein synthesis and cell division, regardless of the cell line used. The genes omcA and omcB (membrane proteins), dnaK (stress response) and hctA (conversion of reticular bodies to elementary bodies) are proposed as markers of the penicillin-induced persistent state in vitro in Chlamydia abortus. In contrast, the supplementation with hormones produced different results depending on the cell line used, suggesting that the effects of hormones on the chlamydial developmental cycle are indirect, via host cells. In addition, Progesterone and, to a lesser degree, 17β-estradiol induced the morphology of aberrant bodies in LE cultures, although this fact did not associate with alterations in studied genes in Chlamydia abortus. Therefore, a common pattern of gene expression, valid for different systems of chlamydial persistence induction, cannot be established.
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    Interaction between the red fox (Vulpes vulpes), helminths and environmental characteristics in semi-arid areas of southeastern Iberian Peninsula
    (Universidad de Murcia, 2022-11-29) Arcenillas Hernández, Irene; Arcenillas Hernández, Irene; Martínez-Carrasco Pleite, Carlos; Ruiz de Ybáñez Carnero, María del Rocío; Escuela Internacional de Doctorado
    En esta Tesis Doctoral se llevó a cabo el estudio de las comunidades de nematodos presentes en los sistemas cardiopulmonar, gastrointestinal y urinario del zorro rojo (Vulpes vulpes) en áreas semiáridas mediterráneas, concretamente en la Región de Murcia (SE de España). Dada la aridez característica de esta región, el estrés hídrico puede ser determinante en el acercamiento de las poblaciones de zorro hacia áreas antropizadas, generando mayores tasas de contacto en la interfaz silvestre-doméstico-humano. Por ello, se analizó la influencia de las variables bióticas y abióticas sobre la abundancia de estas comunidades de parásitos. En este sentido, la obtención de datos fiables de prevalencia e intensidad es esencial para este tipo de estudios epidemiológicos. Por ello, en el Capítulo 1 se evaluó la sensibilidad y exactitud del método de diagnóstico post-mortem de nematodos cardiopulmonares. A la metodología tradicional, consistente en la apertura del árbol traqueobronquial y la cavidad cardiaca, se añadieron dos pasos consecutivos: el estrujado y la digestión artificial del parénquima pulmonar. Los resultados obtenidos indican que este procedimiento es más sensible y exacto en el cálculo de la intensidad parasitaria que el método tradicional. Además, en el caso de especies de nematodos ubicadas en pequeños capilares o bronquiolos, el uso de la digestión artificial facilita la detección de zorros parasitados, disminuyendo la tasa de falsos negativos. En el Capítulo 2 se describieron las comunidades de nematodos del sistema cardiopulmonar y gastrointestinal de 167 zorros. La riqueza total fue de once especies de nematodos, siete gastrointestinales (Pterygodermatites affinis, Uncinaria stenocephala, Toxocara canis, Toxascaris leonina, Spirocerca vulpis, Oxynema crassispiculum y Trichuris vulpis) y cuatro cardiopulmonares (Angiostrongylus vasorum, Crenosoma vulpis, Eucoleus aerophilus y Metathelazia capsulata). Se evaluó la influencia de las variables bióticas y ambientales sobre la abundancia de A. vasorum, C. vulpis, U. stenocephala, T. canis y T. leonina, atendiendo a su importancia sanitaria para cánidos domésticos y, en algunos casos, por tratarse de zoonosis. Los resultados revelaron la importancia de la humedad y la temperatura en este tipo de ambientes, pues son los factores que más influyen en la supervivencia y desarrollo de las formas infectivas de vida libre de estos parásitos o de los hospedadores intermediarios o paraténicos necesarios para que estas especies completen su ciclo biológico. Además, las áreas forestales o agrícolas influyeron significativamente sobre la abundancia, pues permiten el mantenimiento de las condiciones de humedad y temperatura favorables. Por otro lado, la presencia de especies con potencial zoonósico en el área de estudio sugiere la importancia de contar con planes de vigilancia epidemiológica y control de patógenos, debido a la existencia de zonas compartidas entre cánidos silvestres y domésticos, pudiendo producirse la transmisión de estos parásitos en la interfaz silvestre-doméstico-humano. Del mismo modo, las variables ambientales fueron las que más significativamente influyeron en la abundancia de Pearsonema plica (Capítulo 3), nematodo detectado al analizar el sistema urinario (vejiga, riñones y uréteres) de los 167 zorros. A pesar de la aridez del área de estudio, el hallazgo de este nematodo evidencia que en estas zonas también existen lugares con condiciones de humedad adecuadas para el desarrollo del ciclo biológico del parásito. Finalmente, en el Capítulo 4 se realizó la descripción morfométrica y molecular del nematodo broncopulmonar M. capsulata, un espirúrido anteriormente descrito en bronquios y bronquiolos de otras especies de carnívoros. Es la primera vez que se describe en Europa esta especie en el zorro, siendo, además, el primer estudio donde se describen los marcadores moleculares de esta especie de nematodo. Esta información puede ser de gran utilidad para futuros estudios filogenéticos del género Metathelazia spp. o de la familia Pneumospiruridae.
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    Obesidad en Pequeños Animales: Avances en Biomarcadores y Relación con la Obesidad Humana
    (Universidad de Murcia, 2019-12-02) Muñoz Prieto, Alberto; Cerón Madrigal, José Joaquín; Tvarijonaviciute, Asta; Escuela Internacional de Doctorado
    Los objetivos de esta tesis fueron aumentar el conocimiento en biomarcadores de obesidad en perros tales como proteína C-reactiva (CRP), adiponectina (ADP), glucosa, fructosamina e insulina. Además, se evaluó la relación con la obesidad humana en los países europeos. Para llevar a cabo el estudio de CRP, se realizó una validación analítica de un inmunoensayo heterólogo disponible comercialmente para mediciones automáticas de CRP canina y compararlo con tres inmunoensayos homólogos diferentes. Además, se evaluó su capacidad para detectar inflamación en suero canino y la variación de las mediciones de CRP utilizando muestras individuales o agrupadas para fines de validación. La ADP se investigó mediante el desarrollo de un ensayo de alta sensibilidad para medir esta proteína en la saliva y el suero de perros con obesidad y leishmaniosis. Además, se realizó una técnica específica de digestión de proteasas para el aislamiento de isómeros ADP en suero de perro. Los biomarcadores de la homeostasis de la glucosa en la saliva del perro se estudiaron mediante la validación de ensayos automatizados para mediciones de glucosa y fructosamina y un ensayo ELISA para la determinación de insulina. Los ensayos se emplearon para evaluar los cambios en la saliva de los perros después de una administración experimental de glucosa. Finalmente, para investigar las percepciones de los dueños de perros sobre la obesidad entre ellos mismos y sus perros, e identificar factores comunes y posibles factores sociales, ambientales y económicos que podrían relacionarse con la obesidad en estos, se realizó un estudio transversal basado en un cuestionario llevado a cabo en varios países europeos. Los resultados de los artículos que componen esta tesis evidenciaron que el ensayo heterólogo para la determinación de PCR mostró resultados similares a los ensayos homólogos en la evaluación analítica y que por lo tanto indican que el ensayo fue preciso y exacto. Además, fue capaz de detectar valores más altos de CRP en perros con afecciones inflamatorias en comparación con perros sanos. Además, por su parte el nuevo método ultrasensible desarrollado en esta tesis fue capaz de medir ADP en suero y saliva de perros con alta repetitividad y sensibilidad, con un límite de cuantificación más bajo que los ELISA disponibles comercialmente. Las concentraciones de ADP determinadas por este ensayo disminuyeron en perros obesos en comparación con perros delgados y se observó correlación entre suero y saliva. Además, los perros con leishmaniosis presentaron niveles disminuidos de ADP. El uso de digestión selectiva de proteasas detectó los diferentes isómeros de ADP en suero canino y las formas HMW y LMW se incrementaron en perros Beagle después de un programa experimental de pérdida de peso. Finalmente, los factores comunes asociados con la obesidad en los propietarios y sus perros identificados por el estudio de caso de obesidad fueron la edad, el sexo y las actitudes de los propietarios hacia la dieta y la actividad física. Observando que los dueños de perros que no consideraban la obesidad como una enfermedad tenían más probabilidades de tener perros obesos. ABSTRACT The objectives of this thesis were to increase the knowledge in biomarkers of obesity in dogs such as C-reactive protein (CRP), adiponectin (ADP), glucose, fructosamine and insulin. In addition, the relationship with human obesity around European countries was assessed. To carry out the CRP study, an analytical validation of a commercially available heterologous immunoassay for automated measurements of canine CRP and compare it with three different homologous immunoassays were performed. In addition, its capability to detect inflammation in canine serum and the variation of CRP measurements using individual or pooled samples for validation purposes was assessed. ADP was investigate by developing a high-sensitive assay to measure this protein in saliva and serum of dogs with obesity and leishmaniosis. In addition, a specific protease digestion technique for ADP isomers isolation in dog serum was accomplished. The glucose homeostasis biomarkers in dog saliva were studied through the validation of automated assays for glucose and fructosamine measurements and an ELISA assay for insulin determination. The assays were employed to assess the changes in saliva of dogs after an experimental glucose administration. Finally, to investigate dog owner perceptions about obesity among themselves and their dogs, and identify common factors and possible social, environmental and economic drivers that could relate to obesity in dog-owners and their dogs, a cross-sectional questionnaire-based study was performed across multiple European countries. The results of the articles compounding this thesis indicate that the heterologous assay for CRP determination showed similar results to the homologous assays in the analytical evaluation that indicated that the assay was precise and accurate. In addition, it was able to detect higher CRP values in dogs with inflammatory conditions compared to healthy dogs. Moreover, the new ultrasensitive method was able of measure ADP in serum and saliva of dogs with high repeatability and sensitivity, adding a limit of quantification lower than commercially available ELISAs. ADP concentrations determined by this assay were decreased in obese dogs compared with lean dogs and correlation between serum and saliva were observed. In addition, dogs with leishmaniosis presented decrease levels of ADP. The use of selective protease digestion detected the different ADP isomers in canine serum and the HMW and LMW forms were increased in Beagles dogs after an experimental weight loss program. Finally, the common factors associated with obesity in owners and their dogs identified by the obesity-case study were age, gender and owners’ attitudes to diet and physical activity. Remarking that dog-owners who did not consider obesity to be a disease were more likely to have obese dogs
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    The multi-parasite/multi-host system occurring at the wildlife ruminant community of Sierras de Cazorla, Segura y Las Villas National Park
    (Universidad de Murcia, 2021-12-10) Carrau Garreta, Tessa; Ruiz de Ybáñez Carnero, María del Rocío; Tizzani, Paolo; Escuela Internacional de Doctorado
    En esta Tesis Doctoral se ha estudiado la interacción natural que ocurre entre los nematodos parásitos broncopulmonares y gastrointestinales que se encuentran presentes de forma natural en múltiples hospedadores silvestres presentes en el sureste de España. Se realizó el estudio desde el punto de vista multihospedador (parásitos compartidos entre especies diferentes) y multiparasitismo (infección simultánea con varias especies parásitas en un mismo hospedador). Para poder desarrollar este estudio se buscó una localización que permita su investigación ocurriendo de forma natural: el “Parque Natural de las Sierras de Cazorla, Segura y Las Villas” (PNSCSV) en Andalucía, en España. Se estudiaron como hospedadores dos bóvidos (cabra montés [Capra pirenaica]; muflón [Ovis orientalis musimon]) y dos cérvidos (ciervo [Cervus elaphus]; gamo [Dama dama]). Los objetivos principales de esta Tesis Doctoral son: • Descripción de datos epidemiológicos como son, riqueza, prevalencia, abundancia e intensidad parasitaria, en un contexto multiparásito / multihospedador. • Discusión del papel epidemiológico de la transmisión de estos parásitos, e intentando explicar la helmintofauna hallada desde una perspectiva ecológica. • Validación de la técnica de diagnóstico Baermann-Wetzel comparando las muestras pulmonares y fecales obtenidas durante las necropsias usando el análisis Blant-Altman. En el Capítulo 1 se estudiaron los nematodos gastrointestinales de los cuatro especie de rumiantes silvestres (n = 252). El 81,52% de los animales analizados resultaron estar parasitados y se identificaron un total de 29 especies. La prevalencia difirió significativamente entre las especies hospedadoras (gamo91,5%; muflón, 85,5%; cabra montés, 83,3%; ciervo, 61,4% y el muflón presentó la mayor riqueza parasitaria (12 especies diferentes), representando un claro ejemplo de un escenario de multiparasitismo. Además la estructura de la comunidad de parásitos se vio significativamente influenciada por el hospedador, con la mayor prevalencia y riqueza de parásitos apareciendo consistentemente en muflones. Estos resultados sugieren un punto de dispersión de parásitos originado por el muflón. Se demostraron diferencias significativas entre las 11 especies de nematodos compartidas por todas las especies hospedadoras. Estos hallazgos destacan la capacidad de los parásitos para adaptarse a la comunidad de hospedadores y dar forma a su distribución ecológica de acuerdo con las especies de hospedadoras más adecuadas disponibles. Siguiendo la línea anterior, en el Capítulo 2 se abordaron los nematodos broncopulmonares de la misma población de rumiantes silvestres. Casi la mitad (48,0%) de los animales estaban infectados con nematodos broncopulmonares. Se identificaron 7 nematodos diferentes, de los cuales 2 géneros (Protostrongylus spp. y Dictyocaulus spp.) y 3 especies (Cystocaulus ocreatus, Muellerius capillaris y Neostrongylus linearis) se registraron en al menos dos rumiantes, siendo el muflón el hospedador más común. En este caso, se pudo observar un efecto significativo entre las diferentes áreas de muestreo del PNSCSV, habiendo mayor abundancia de parásitos en la parte central del parque. En este estudio el muflón vuelve a ser la clave epidemiológica en la red natural de interacciones, mostrando una alta prevalencia y riqueza de nematodos broncopulmonares que son compartidos con las otras especies de rumiantes silvestres simpátricos. En el Capítulo 3 se valida la técnica de Baermann-Wetzel de diagnóstico de nematodos broncopulmonares. Es el método más habitual para el diagnóstico de nematodos broncopulmonares y se basa en la migración activa y el movimiento de sus larvas de primer estadio (L1). Las muestras de tejido pulmonar se utilizan para el diagnóstico post mortem del estatus parasitario de una población silvestre controlada, pero este tipo de muestra no siempre está disponible. Las muestras fecales son una opción no invasiva para el monitoreo de parásitos, aunque escasa en los estudios de comunidades silvestres. El estudio demostró que existe una sensibilidad similar para ambos métodos (86,7% para tejido pulmonar y 84,1% para heces). Al comparar los dos origenes se pudo observar un buen nivel de concordancia, así como una sensibilidad similar entre los dos tipos de muestra, validando el uso de muestras fecales como una alternativa menos invasiva y rentable para el seguimiento de la infección por nematodos broncopulmonares en poblaciones de rumiantes silvestres. Los hallazgos obtenidos a lo largo de los tres capítulos que conforman esta Tesis Doctoral aportan una valiosa información que permite conocer mejor este sistema natural multihospedador y de multiparasitismo que existe entre estas cuatro especies de rumiantes silvestres en el sureste de la península ibérica, destacando la importancia de cada uno de estos hospedadores en el mantenimiento del ciclo biológico de los nematodo.