Browsing by Subject "Microscopía óptica"
Now showing 1 - 6 of 6
Results Per Page
Sort Options
- PublicationOpen AccessAdaptive optics and pulse compression in multiphoton microscopy : applications to ocular tissues= Óptica adaptativa y comprensión de pulsos en microscopía muiltifotónica: aplicaciones en tejidos oculares(2016-12-21) Skorsetz, Martin; Bueno García, Juan Manuel; Artal Soriano, Pablo; Escuela Internacional de DoctoradoDurante las dos últimas décadas las técnicas de microscopía multifotónica (o no lineal), entre ellas la fluorescencia a 2 fotones (TPEF, del inglés Two-Photon Excitacion Fluorescence) y la generación de segundo armónico (SHG, del inglés Second Harmonic Generation), se han convertido en potentes herramientas para la visualización de tejidos biológicas. Dichas técnicas permiten el registro de imágenes de capas profundas de las muestras debido a su confocalidad intrínseca. Sin embargo, las aberraciones del sistema óptico y del propio tejido limitan la calidad de la técnica. La calidad de las imágenes registradas se reduce progresivamente conforme los planos se sitúan más dentro de la muestra. La incorporación de óptica adaptativa permite la manipulación del frente de onda para minimizar el impacto de dichas aberraciones y restaurar la calidad de imágenes. Por otra parte, la dispersión óptica de los componentes del microscopio así como de la propia muestra, hacen que las componentes espectrales de los pulsos ultracortos utilizados viajen a diferentes velocidades. Esto se traduce en un ensanchamiento temporal de los pulsos que reduce la eficiencia de los procesos multifotónicos. Para compensar estos efectos de dispersión normalmente se utilizan los compresores de pulsos, capaces de modificar la fase de los diferentes componentes de frecuencia de los pulsos y comprimirlo temporalmente. En ese sentido la presente Tesis Doctoral se concentra en mejorar las imágenes de microscopia multifotónica mediante manipulaciones espaciales y temporales de un haz láser ultrarrápido ultraintenso por medio de la corrección de aberraciones y la compresión de pulsos, respectivamente. Para corregir el frente de onda se ha utilizado un modulador espacial de cristal líquido y un espejo deformable. Para optimizar las propiedades temporales de los pulsos de luz se ha empleado un compresor de pulsos variable. Se ha prestado especial atención a los efectos producidos en las imágenes multifotónicas de los tejidos oculares. Los principales objetivos de este trabajo son los siguientes: • Manipulación controlada del frente de onda del haz láser para mejorar plano a plano las imágenes de microscopía multifónica de tejidos gruesos. • Análisis de los efectos de diferentes parámetros sobre la corrección de la frente de onda: profundidad del plano, tamaño de la imagen registrada y secuencia de los coeficientes de Zernike utilizados. • Estudio del efecto de la aberración esférica en función de la profundidad de la muestra. • Determinación de un valor global de aberración esférica que permita la optimización de imágenes multifotónicas de muestras gruesas enteras y así evitar correcciones individuales plano a plano. • Pre-compensación temporal del pulso para mejorar la calidad de las imágenes de microscopía multifotónica. • Evaluación de la reducción de la potencia del láser necesaria para minimizar el daño en muestras biológicas durante el uso de la compresión de pulsos. Estructura de la Tesis La presente Tesis Doctoral se divide en 6 capítulos que se describen de forma somera a continuación. El Capítulo 1 incluye una descripción general de las diferentes técnicas de microscopía, especialmente de la microscopía multifotónica, así como de los láseres de femtosegundos. También se revisan los conceptos de óptica adaptativa y de compresión temporal de pulsos. En el Capítulo 2 se describe el microscopio multifotónico aquí utilizado. El sistema combina un microscopio invertido con un láser de femtosegundos, una unidad de escaneo, un motor-Z y una unidad de detección. Las señales TPEF y SHG se registraron en reflexión utilizando un objetivo de no inmersión. El Capítulo 3 se centra en el desarrollo de una técnica de óptica adaptativa sin sensor de frente de onda utilizando un algoritmo de tipo hill-climbing (o “aproximaciones sucesivas”) con el objeto de mejorar la calidad de las imágenes obtenidas con el microscopio multifotónico descrito en el Capítulo 2. Como elemento adaptativo se utiliza un modulador espacial de cristal líquido con el que se generan los modos de Zernike de forma sistemática durante el registro de imágenes. Un método alternativo para aumentar la profundidad de foco en microscopía multifotónica se presenta en el Capítulo 4. La técnica se basa en la manipulación del patrón de aberración esférica del haz incidente con un módulo de óptica adaptativa utilizando un espejo deformable y un sensor de Hartmann-Shack. En el Capítulo 5 se estudian de los efectos sobre la calidad de las imágenes multifotónicas de una técnica de pre-compresión temporal de pulsos a través de un compresor variable formado por una pareja de prismas. La configuración óptima del compresor de pulsos se determinará con un procedimiento basado en el registro de tomografías de las muestras bajo estudio. Adicionalmente, se presenta un método simple basado en la reducción de la potencia del láser para evitar producir daño sobre las muestras biológicas cuando se utilizan técnicas de compresión de pulsos. Finalmente el Capítulo 6 contiene las conclusiones de este trabajo. Conclusiones de la Tesis 1. Se ha desarrollado un microscopio multifotónico que incluye un modulador espacial de cristal líquido en la vía de iluminación para corregir plano a plano las aberraciones inducidas por la muestra. El procedimiento experimental se basa en una técnica de óptica adaptativa sin sensor de frente de onda y un algoritmo tipo hill-climbing. A pesar de utilizar un objetivo en aire con baja apertura numérica y una configuración de microscopio en reflexión, el método es capaz de generar imágenes TPEF y SHG con calidad notablemente mayor. 2. Aunque la corrección de óptica adaptativa es particular para cada muestra, la cantidad de aberración aumenta linealmente con la profundidad. Por otra parte, el frente de onda que optimiza la imagen en una zona determinada no depende del área registrada. Sin embargo, esto puede depender de la estructura de la muestra y la profundidad del plano de interés. 3. La combinación de los modos de Zernike que optimiza la imagen multifotónica depende de la secuencia de control de la corrección. El algoritmo hill-climbing es eficiente para ambas direcciones creciente y decreciente. Aunque los mapas de aberración óptimos difieren entre ambas secuencias de control, las imágenes finales mejoradas son similares. 4. Se encontró que la aberración esférica es el término de aberración dominante, especialmente en los planos más profundos de las muestras. La contribución de este término de aberración es tal, que las imágenes que proporciona son de calidad similar a las obtenidas cuando se tiene en cuenta también otros términos como el coma y el astigmatismo. 5. Se ha utilizado un módulo de óptica adaptativa compuesto por un sensor de Hartmann-Shack y un espejo deformable para manipular el patrón de aberración esférica del haz láser incidente e incrementar la profundidad de foco. 6. Utilizando imágenes de tomografía rápida se determinó un patrón de aberración esférica único y óptimo que evita la corrección plano a plano. Un único valor de aberración esférica reduce la calidad de imagen de los planos más superficiales. Sin embargo las imágenes en las capas más profundas mejoran con respecto a las condiciones originales. 7. Para pre-compensar la dispersión de los pulsos láser producidos por la óptica del microscopio y la muestra se ha usado un compresor de pulsos variable. Esta operación aumenta la eficiencia de los procesos multifotónicos de forma que las señales TPEF y SHG aumentan un factor 2x o más. 8. El estado de compresión óptimo que proporciona la mejor imagen depende de la muestra, pero para cada una de ellas es constante con la profundidad. 9. Esta operación de compresión de pulsos permite la reducción de la potencia del láser de iluminación, lo que minimiza los posibles efectos secundarios no controlados de daño térmico o de foto-blanqueo (del inglés photo-bleaching). Esto es de vital importancia en muestras biológicas, más propensas a este tipo de daño. Los resultados muestran que la operación de compresión permite una reducción de la potencia de aproximadamente un 50%. Summary During the last two decades multiphoton (or nonlinear) microscopy, including two photon excitation fluorescence (TPEF) and second harmonic generation (SHG), has become a powerful tool for visualization of biological tissue. Such techniques allow the registration of images of deeper layers of the samples due to their inherently confocality. However, aberrations in the optical system and the specimen-induced ones limit the quality of this technique. The quality of the recorded images is progressively reduced when imaging deeper layers within the sample. The implementation of adaptive optics techniques allows the manipulation of the wavefront to minimize the impact of those aberrations and restore the quality of the images. Furthermore, the optical dispersion of the microscope components and the sample itself also affect the imaging recording technique. Due to this, different frequency components of the ultrashort pulses travel at different speed through the optics of the microscope. This leads to a temporal broadening of the pulses, which reduces the efficiency of multiphoton processes. To compensate for these dispersion effects pulse compressors are usually used, which are able to modify the phase of the different frequency components of the pulse. In that sense, this Doctoral Thesis is focused on improving multiphoton microscopy images by spatial and temporal beam manipulations of the ultra-fast ultra-intense laser beam through the correction of aberrations and pulse compression, respectively. To correct the wavefront, both a liquid-crystal spatial light modulator and a deformable mirror were used. To optimize the temporal properties of the pulses, a variable pulse compressor has been employed. Particular attention has been paid to the effects on multiphoton images of ocular tissues.
- PublicationOpen AccessComparative value of microscopy, serology and real time PCR in the diagnosis of asymptomatic canine leishmania infantum infection(Murcia: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Murcia, 2012) Risueño, J.; Bermejo, E.; Muñoz García, C.I.; Chitimia, I.; Del Río Alonso, Laura; García Martínez, Juan Diego; Fisa, R.; Riera, C.; Martínez Ramírez, A.; Meseguer Meseguer, José María; Murcia, L.; Segovia Hernández, Manuel; Berriatua Fernández de Larrea, Eduardo; Goyena Salgado, Elena; Jiménez Montalbán, Pedro Javier; Facultad de Veterinaria; Facultad de MedicinaThe sensitivity (SE) of cytological examination of spleen and lymphnode smears by optical microscopy (OM), antibody-ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) and real-time (rt) PCR (polymerase chain reaction), for diagnosing asymptomatic canine Leishmania infantum infection was investigated in 110 apparently healthy dogs from southeast Spain. The percentage of OM, ELISA and rtPCR positive dogs were 2% (2/110), 27% (26/97) y 67% (39/58), respectively, although the percentage of rtPCR-positive dogs were 35-41% in individual tissues and 9% in blood. The estimated SE (95% confidence interval) of OM relative to the rtPCR and ELISA tests was 5% (0-12) and 8% (0-18), respectively. Results confirm that most apparently healthy dogs from L. infantum endemic areas are infected, that approximately only one third of these infected dogs develop antibodies and that very few have parasite loads that are high enough to allow detection by OM. As a result, the degree of agreement between rtPCR, ELISA and OM for L. infantum diagnosis in subclinnically infected dogs is low.
- PublicationOpen AccessDesarrollo de un sistema combinado de microscopía óptica y microscopía de fuerzas.(2013-06-11) López Elvira, Elena; Baró Vidal, Arturo M.; Colchero Paetz, Jaime Virgilio; Facultad de QuímicaEn este trabajo se ha desarrollado un microscopio de fuerzas (SFM) provisto de microscopía electrostática (ESFM) y microscopía Kelvin (KPM) especialmente diseñado para integrarse en un microscopio óptico invertido de forma que combine simultáneamente las técnicas de campo cercano con las técnicas ópticas. Tras una introducción (capítulo 1) y la descripción de las técnicas experimentales (capítulo 2), se detallan las características del diseño de un primer prototipo, así como las medidas realizadas con él con el fin de comprobar su correcto funcionamiento (capítulo 3). El capítulo 4 muestra el diseño de un segundo prototipo con las mejoras que incorpora respecto al primero, que lo convierten en un sistema más completo, versátil y fácil de manejar. También figuran las medidas realizadas con él. El capítulo 5 muestra un estudio de fotodegradación en polímeros conductores en función de la radiación incidente, combinando microscopía electrostática y Kelvin con técnicas ópticas. Palabras clave Microscopía de Fuerzas (SFM) Microscopía óptica Microscopía Electrostática (ESFM) Microscopía Kelvin (KPM) Polímeros conductores Abstract In this work we have developed an Scanning Force Microscope (SFM) equipped with Electrostatic and Kelvin Probe Microscopy (ESFM, KPM), specially designed for integration into an inverted optical microscope in order to combine near-field techniques with optical techniques. After an introduction (Chapter 1) and the description of the experimental techniques (Chapter 2), are described the features of the design of a first prototype, as well as the measurements made with it in order to verify proper operation (Chapter 3). The Chapter 4 shows the design of a second prototype that incorporates the improvements over the first, making it more comprehensive, versatile and easy to handle. Also are shown the measurements performed with it. The Chapter 5 shows a photodegradation study of conductive polymers as a function of incident radiation combining KPM with optical techniques. Keywords Scanning Force Microcopy (SFM) Optical Microscopy Electrostatic Scanning Force Microcopy (ESFM) Kelvin Probe Microscopy (KPM) Conducting polymers
- PublicationOpen AccessInteracción de la TGB1 del virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) con factores de transcripción de tomate(Universidad de Murcia, 2026-05-11) Rodríguez Úbeda, Jesús Enmanuel; Aranda Regules, Miguel Ángel; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de DoctoradoEn esta tesis doctoral se ha estudiado la proteína 1 del bloque de tres genes (TGB) del virus del mosaico del pepino dulce (PepMV; especie Potexvirus pepini) con un interés especial en su papel en el núcleo. PepMV, perteneciente al género Potexvirus de la familia Alphaflexiviridae, es actualmente el agente causante de una pandemia en tomate cultivado, con importantes pérdidas económicas asociadas. Además de su relevancia agronómica, PepMV se ha consolidado como un modelo de referencia en virología vegetal gracias al desarrollo de numerosas herramientas biotecnológicas y la caracterización de su genoma e interacción con el huésped. La TGB1 de PepMV desempeña un papel central en distintas etapas del ciclo infectivo, incluyendo el silenciamiento de ARN, aunque muchas de sus funciones han sido inferidas por homología con virus relacionados. El objetivo de esta tesis doctoral ha sido caracterizar experimentalmente la localización subcelular de la TGB1 de PepMV, con especial interés en su función nuclear, identificando y caracterizando factores nucleares del huésped interactores de TGB1. En la primera parte de esta tesis se caracterizó la localización subcelular de la TGB1 de PepMV, determinando que se trata de una proteína soluble con una distribución núcleo-citoplásmica en células sanas, con exclusión del nucleolo, que durante la infección se acumula de forma preferente en plasmodesmos y orgánulos de replicación viral (VROs). Aunque en el VRO se concentran gran parte de las funciones asociadas la infección, la presencia consistente de TGB1 en el núcleo sugiere un papel funcional adicional en este compartimento subcelular. Para abordar esta cuestión, en la segunda parte de esta tesis doctoral, se caracterizaron factores nucleares del huésped interactores de la TGB1 de PepMV identificados a través de un escrutinio de doble híbrido en levadura. El análisis in silico de las secuencias obtenidas permitió identificar las proteínas SlALOG1 y SlbZIP42, pertenecientes a las familias de factores de transcripción ALOG y bZIP, respectivamente. Mientras que la familia bZIP participa en una amplia variedad de procesos biológicos, incluyendo respuesta a estrés tanto abiótico como biótico, la familia ALOG únicamente ha sido descrita como reguladores homeóticos del desarrollo. Tanto SlALOG1 como SlbZIP42 mostraron localización nuclear en células sanas, donde colocalizaron con la TGB1 de PepMV, y se acumularon de forma preferente en los VROs durante la infección. El análisis comparativo con otros miembros de ambas familias mostró un comportamiento diferencial. Únicamente SlALOG1, dentro de la familia ALOG, fue capaz de acumularse en los VROs, mientras que varios miembros del clado I de la familia bZIP, incluyendo SlbZIP42, pero no SlbZIP11, presentaron esta capacidad, lo que sugiere funciones específicas y no redundantes durante la infección por PepMV. Los ensayos de susceptibilidad a PepMV mostraron una acumulación viral significativamente menor en plantas slalog1 y slbzip42 respecto a plantas de genotipo WT. Además, los análisis transcriptómicos en mutantes slalog1 y slbzip42 mostraron un papel para ambas proteínas como reguladores maestros de la transcripción, implicados principalmente en procesos redox y de regulación hormonal.
- PublicationOpen AccessMicroscopía multifotónica del ojo humano en vivo : desarrollo y optimización de un dispositivo compacto para uso clínico(Universidad de Murcia, 2022-12-16) Martínez Ojeda, Rosa María; Bueno García, Juan Manuel; Artal Soriano, Pablo; Escuela Internacional de DoctoradoDurante las últimas décadas la microscopía multifotónica se ha convertido en una herramienta de gran utilidad para visualizar tejidos biológicos. En particular, la microscopía de generación de segundo armónico (SHG, del inglés Second Harmonic Generation) tiene una ventaja importante respecto a métodos de microscopía convencionales, debido a su capacidad para observar tejidos formados por colágeno tipo I, como la esclera y la córnea, sin necesidad de operaciones de teñido y fijado. Dichas estructuras oculares son las que vamos a estudiar en esta Tesis Doctoral. Para ello, presentamos un prototipo de microscopio multifotónico compacto que nos servirá para examinar el segmento externo del ojo humano en vivo. Este nuevo sistema requiere una calibración de los parámetros de adquisición de imágenes óptimas en tiempos de exposición reducidos, buscando un compromiso entre la calidad de imagen y la seguridad de los tejidos bajo estudio. La evaluación de la calidad de imágenes, registradas con diferentes parámetros, ha permitido confirmar que se pueden obtener imágenes óptimas, con alta resolución, en tiempos de exposición menores de 1 s. Una vez evaluadas las condiciones de registro óptimo, fue necesario saber si el sistema es apto para su uso en vivo, teniendo en cuenta parámetros de la fuente láser, el tiempo de exposición y el ángulo visual, siguiendo la norma ANSI Z136.1. Los cálculos de la exposición máxima permitida (Maximum Permissible Exposure, MPE) para el microscopio multifotónico indican que es seguro para las condiciones experimentales propuestas. Tras el análisis de seguridad, se procedió al registro de imágenes en condiciones en vivo en ojos de voluntarios sanos, registrando imágenes de la córnea, la esclera y el limbo esclerocorneal, con suficiente resolución como para detectar fibras y células individuales, comparables a condiciones ex vivo, con alta repetibilidad. En algunos casos, movimientos involuntarios del ojo, pueden dar lugar a una degradación de la imagen. Además, como en todas las muestras biológicas, en el ojo también se producen fenómenos tipo scattering, reduciendo la calidad de las imágenes. Por esta razón se ha propuesto la mejora de imágenes multifotónicas mediante diferentes técnicas. Se ha analizado la utilidad de un procedimiento de deconvolución ciega marginal. Este método permite restaurar imágenes cuando se cuenta con poca información del sistema experimental, sin necesidad de supervisar el proceso. Con su aplicación se mejora la calidad de las imágenes deconvolucionadas, así como su resolución, en comparación a las imágenes originales. Otro método para mejorar las imágenes registradas ha sido el uso de luz polarizada radialmente, mediante una lámina “S-waveplate”. Las imágenes adquiridas con la luz radial se han comparado con imágenes registradas, cuasi simultáneamente, con luz polarizada circularmente. El aumento en la calidad de imágenes adquiridas con luz radial es destacable, especialmente con la profundidad, donde las imágenes se degradan más debido a las aberraciones y el scattering. Finalmente, se han comparado imágenes registradas con un láser de pulsos de menos de 10 fs, con dimensiones reducidas y mayor flexibilidad para la implementación de un prototipo de microscopio multifotónico clínico, y con un láser de Ti:Zafiro de más de 120 fs, de grandes dimensiones y alto coste. Los resultados muestran que el primero se ve más afectado por la acción de la dispersión cromática, por lo que es necesario aumentar la potencia de salida del láser para obtener imágenes de cualidades similares a las adquiridas con el láser de Ti:Zafiro. Los métodos de mejora aplicados, con mayor o menor éxito, permiten obtener imágenes multifotónicas óptimas que aportan información sobre las estructuras de la córnea y la esclera, sin poner en riesgo la integridad de los tejidos, ya que se mantienen varios órdenes de magnitud por debajo de los niveles de exposición máximos permitidos para el ojo humano.
- PublicationOpen AccessPolarización y microscopía multifotónica para el análisis de estructuras oculares(2016-02-15) Ávila Gómez, Francisco Javier; Bueno García, Juan Manuel; C.W.Campbell, Melanie; Facultad de MedicinaLa microscopía multifotónica, y en particular la generación de segundo armónico SHG (del inglés Second Harmonic Generation) constituye una potente herramienta para la visualización de tejidos biológicos formados por colágeno. La técnica es intrínsecamente confocal y permite el registro de imágenes de capas profundas de las muestras, con baja foto-toxicidad sobre el tejido. Para el estudio de la organización de dichos tejidos, la microscopía SHG se ha combinado con el análisis de Fourier o con técnicas de polarización. Éstas han permitido tanto la mejora de la calidad de las imágenes SHG, como el desarrollo de métodos para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades asociadas a desórdenes del colágeno. En esta Tesis Doctoral se propone el uso del tensor de estructura como método para el cálculo de parámetros de isotropía sobre la imagen SHG. En tejidos oculares formados por colágeno, dicha herramienta se ha usado para la caracterización de la organización global de las fibras y la clasificación objetiva en función de su distribución espacial: cuasi-alineados, parcialmente organizados, organización con dos direcciones preferentes y desorganizados. En segundo lugar, se ha desarrollado un modelo teórico de la intensidad de la señal SHG en colágeno en función de la polarización incidente. La comparación entre dicho modelo y los resultados experimentales en muestras de colágeno con diferentes grados de organización no sólo ha permitido comprobar la fiabilidad del modelo, sino también obtener una expresión analítica para el cálculo de la organización interna, y establecer su relación con la organización externa del colágeno. Además, la modulación de la señal SHG en función de la polarización se ha utilizado como método diferencial en el proceso patológico conocido como queratocono corneal. Finalmente, se ha aplicado con éxito el formalismo de Stokes-Mueller para, en primer lugar, estudiar la relación entre la diatenuación y la organización del colágeno (tanto externa como interna) y, en segundo lugar, para mejorar la visualización de dichas estructuras. Multiphoton microscopy, and in particular Second Harmonic Generation (SHG), provides a powerful tool for collagen-based tissues imaging. The technique is intrinsically confocal, allowing the imaging of deeper layers of the sample with reduced photodamage. SHG microscopy has been combined with Fourier analysis and polarization techniques to study tissue organization. These procedures led to both SHG image improvement and the development of methods for diagnosis and tracking of pathologies related to collagen disorders. Throughout this PhD Thesis, the structure tensor is proposed as a method to compute the isotropy across SHG images. Its application to collagen-based ocular tissues has achieved the characterization of the global organization of their fibers, as well as an objective classification as a function of their spatial distribution (quasi-aligned, partially organized, organized along two preferred orientations and non-organized collagen samples). A theoretical model for the computation of the SHG signal intensity from collagen, as function of the incident polarization, has been developed. The comparison between numerical simulations and experimental results in collagen samples with different degrees of organization, permitted to test the reliability of the model and to obtain an analytical expression to calculate the internal organization and establish a relationship with the external organization. The modulation of the SHG signal as function of the incident polarization could be employed as a technique to differentiate pathological keratoconic corneas from healthy ones. Finally, the Stokes-Mueller formalism has successfully been applied to study the relationship between diattenuation and collagen organization (both internal and external) and to improve the visualization in such structures.