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    Estudio del factor XII aberrante en diferentes patologías : Nuevas perspectivas de esta molécula pleiotrópica
    (Universidad de Murcia, 2018-11-22) López Gálvez, Raquel; Corral de la Calle, Javier; Morena Barrio, María Eugenia de la; Escuela Internacional de Doctorado
    El Factor XII (FXII) continúa siendo un elemento desconocido y enigmático a pesar de ser una molécula pleiotrópica y de estar implicado en diversos sistemas como coagulación, inflamación, fibrinólisis y complemento. Para obtener nueva información sobre esta proteína, decidimos estudiar 3 patologías con presencia de moléculas de FXII aberrantes. La caracterización de dicho FXII aberrante podría aportar nueva información molecular, bioquímica, funcional y patológica. En primer lugar, identificamos fortuitamente, un paciente con leucemia aguda que presentaba todo su FXII plasmático 5 KDa mayor que el FXII silvestre. La base congénita de este defecto se demostró al observar el mismo FXII en su hermano. Sin embargo, la secuenciación completa del gen F12 no identificó ninguna alteración molecular que explicara el FXII aberrante. Además, ante ciertas condiciones (activación con sílica o dextrán sulfato (DXS); incremento del % de SDS, o purificación del FXII por cromatografía de afinidad), se detectaba el FXII silvestre. Este resultado sugiere que el FXII aberrante podría explicarse por una interacción casi covalente del FXII silvestre con un péptido de 5 KDa. La purificación y análisis proteómico del FXII aberrante sugirió que podría ser un péptido de GRIP1. De hecho, la secuenciación completa del exoma identificó una mutación en este gen que compartían los dos hermanos. Funcionalmente, el FXII aberrante parece ser menos sensible a la activación con dosis bajas de sílica y DXS, lo que podría contribuir a explicar las casi nulas complicaciones que ha presentado el paciente a lo largo de un extenso y agresivo tratamiento oncológico que incluyó dos trasplantes alogénicos. En segundo lugar, estudiamos 58 pacientes con desórdenes congénitos de glicosilación (CDGs). Demostramos que este defecto no provoca deficiencia de FXII, pero si la aparición en plasma de una forma de FXII hipoglicosilada. Las características de la cadena pesada del FXII tras su activación demostró que todo el FXII hipoglicosilado carece del N-glicano localizado en posición Asn414. La expresión recombinante de variantes mutadas en células de insecto afectando a los dos sitios de N-glicosilación descritos en el FXII confirmó que la ausencia de N-glicano en Asn230 es clave para el correcto plegamiento y/o secreción de la molécula. Además, el FXII hipoglicosilado parece más sensible a su activación y a la generación de calicreína. Por último, nuestro proyecto reclutó 33 pacientes con angioedema hereditario tipo III (FXII-HAE) portadores de la variante patogénica p.Thr309Lys. Esta patología es hasta la fecha la única claramente asociada con variantes patogénicas en el gen del F12. Todos menos 3 portadores de esta mutación presentaban dos formas de FXII en plasma. El tamaño del FXII aberrante no podía justificarse por un defecto de O-glicosilación como se había propuesto. De hecho, la forma recombinante mutada, también expresada en células de insecto, tenía el mismo tamaño que la forma silvestre. Los estudios realizados sugirieron que esta forma aberrante podría ser resultado de un procesamiento alternativo del exón 9. El FXII aberrante tanto el plasmático como el recombinante, era más sensibilidad a activarse ante menores estímulos, generando calicreína, pero sin causar activación de la coagulación. En conclusión, el estudio del FXII aberrante en diferentes patologías nos ha permitido conocer la complejidad de esta proteína, sus interacciones y la repercusión que una modificación postraduccional, como la glicosilación, tiene en su secreción y funcionalidad. Factor XII (FXII) remains an unknown and enigmatic element despite being a pleotropic molecule and being involved in various systems such as coagulation, inflammation, fibrinolysis and complement. To obtain information about this protein, we decided to study 3 patterns with the presence of aberrant FXII molecules. The characterization of this aberrant FXII could provide new molecular, biochemical, functional and pathological information. First, we identified a patient with acute leukemia who presented all of his FXII in plasma 5 KDa greater than the wild FXII. The congenital basis of this defect was demonstrated by observing the same FXII in his brother. However, the complete sequencing of the F12 gene did not identify any molecular alteration that would explain the aberrant FXII. In addition, under certain conditions (activation with silica or dextran sulfate (DXS), increase in SDS %, or purification of FXII by affinity chromatography), wild FXII was detected. This result suggests that aberrant FXII could be explained by an almost covalent interaction of wild FXII with a 5 KDa peptide. The purification and proteomic analysis of the aberrant FXII suggests that it could be a GRIP1 peptide. In fact, the complete sequencing of the exome identifies a mutation in this gene shared by the two brothers. Functionally, aberrant FXII seems to be less sensitive to activation with low doses of silica and DXS, which could contribute to explain the almost zero complications that the patient has presented throughout an extensive and aggressive oncological treatment that included two allogeneic transplants. Second, we studied 58 patients with congenital glycosylation disorders (CDGs). This defect does not cause FXII deficiency but the appearance in plasma of a hypoglycosylated form of FXII. The characteristics of the heavy chain of FXII after its activation showed that all the hypoglycosylated FXII lacks the N-glycan located in position Asn414. The recombinant expression of mutated variants in insect cells affecting the two N-glycosylation sites described in FXII confirms that the absence of N-glycan in Asn230 is key for the correct folding and/or secretion of the molecule. In addition, hypoglicosylated FXII seems more sensitive to its activation and to the generation of kallikrein. Finally, our project included 33 patients with hereditary angioedema type III (FXII-HAE) carrying the p.Thr309Lys mutation. Until now, this pathology is clearly associated with mutations in the F12 gene. All patients, except 3 who were carriers of this mutation, presented two forms of FXII in plasma. The size of the aberrant FXII could not be justified by a defect in O-glycosylation as proposed. In fact, the mutated recombinant form, also expressed in insect cells, had the same size as the wild type. The studies carried out suggest this aberrant form could be the result of an alternative processing of exon 9. The aberrant FXII, both plasma and recombinant, is more sensitive to activation in response to lower stimulation, generating kallikrein but without causing coagulation activation. In conclusion, the study of aberrant FXII in different pathologies has allowed us to know the complexity of this protein, its interactions and the repercussion that a post-translational modification, such as glycosylation, has on its secretion and functionality.
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    Evaluación inmunológica en pacientes con fibromialgia Tipo 1
    (Universidad de Murcia, 2019-12-04) Salgado Cecilia, María Gema; Martínez García, Pedro; García Alonso, Ana Mª; Gimeno Arias, Lourdes; Escuela Internacional de Doctorado
    OBJETIVOS. 1. Determinar el papel de los mecanismos autoinmunes en la patogenia de la fibromialgia. Evaluar la presencia de anticuerpos anti-serotonina, anticuerpos anti-gangliósidos y otros autoanticuerpos en sangre periférica de pacientes con fibromialgia y controles sanos así como analizar la variación de estos anticuerpos en función del estado clínico de los pacientes. 2. Evaluar la presencia de disbalances entre citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias y estudiar la asociación de los polimorfismos genéticos de estas citoquinas con la susceptibilidad y manifestaciones clínicas de la fibromialgia. 3. Analizar el polimorfismo de los genes KIR y HLA de clase I y clase II en pacientes con fibromialgia y controles sanos con el objetivo de conocer su posible asociación con la susceptibilidad y manifestaciones clínicas de la enfermedad. METODOLOGÍA Determinación de anticuerpos IgG e IgM anti-serotonina: ELISA tipo sándwich y anticuerpos anti-Gangliósidos mediante dot-blot. Los niveles de serotonina en suero se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La determinación de citoquinas en suero se realizó con tecnología Luminex, con la excepción del TGF-β1 que se realizó mediante ensayo ELISA tipo sándwich. El polimorfismo de los genes de las citoquinas se determinó mediante un ensayo de discriminación alélica con sondas Taqman específicas. El estudio del polimorfismo VNTR del gen de la IL-4 se realizó PCR convencional empleando cebadores específicos para amplificar la región de interés El tipaje de los genes HLA-A, B, C, y KIR se realizó mediante las técnicas de PCR-SSO y PCR-SSP. CONCLUSIONES: 1. Los niveles de serotonina se encuentran disminuidos en el suero de los pacientes con FM pero no parecen asociarse con la severidad de las manifestaciones clínicas. 2. La prevalencia de anticuerpos anti-serotonina IgG e IgM y los niveles séricos de estos anticuerpos se encuentran aumentados en pacientes con FM respecto a la población sana. 3. La prevalencia de anticuerpos anti-serotonina IgG e IgM es mayor en pacientes de FM con niveles de ansiedad moderada, severa o grave que en pacientes con niveles de ansiedad leve, lo que sugiere una asociación de estos anticuerpos con formas más severas de la enfermedad. 4. Los niveles séricos de las citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias estudiadas son similares en pacientes con FM y en la población sana. 5. Los SNPs de los genes de las citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias estudiadas no parecen asociarse con la susceptibilidad al desarrollo de FM. 6. El genotipo AA del SNP rs16944 del gen de la IL-1β se asocia con una manifestación grave o muy grave de la enfermedad según el test FIQ en pacientes con FM, por el contrario, la presencia del genotipo GA de este SNP se asocia con una manifestación más leve de la enfermedad. 7. El genotipo AA del SNP rs1143634 del gen de la IL-1β se asocia con una manifestación moderada o grave de la FM según el test CGI. 8. El genotipo 3R/3R de la región VNTR del gen de la IL-4 se asocia con una peor calidad de vida en pacientes con FM, por el contrario el genotipo 2R/3R se asocia a una mejor calidad de vida de los mismos. 9. El genotipo GG del SNP rs1800469 del gen del TGF-β se asocia a una mejor calidad de vida de los pacientes con FM, por el contrario el genotipo AG se asocia con niveles de ansiedad severa o grave en estos pacientes. 10. El polimorfismo de los genes KIR y HLA no se asocia con la susceptibilidad a desarrollar FM ni con las manifestaciones clínica de la misma. 11. Este trabajo confirma que la FM, además de estar condicionada por factores genéticos, desde el punto de vista inmunológico puede tener mecanismos etiopatogénicos diferentes como son los fenómenos autoinmunes o los fenómenos de desregulación de los mecanismos inflamatorios, hecho que puede tener relevancia clínica a la hora de evaluar adecuadamente a los pacientes así como para poder diseñar tratamientos más personalizados.