Browsing by Subject "Fisiología de la reproducción"

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    Estudio de la expresión génica y polimorfismos relacionados con la espermatogénesis y la infertilidad
    (Universidad de Murcia, 2022-11-22) Cots Rodríguez, Paula; Avilés Sánchez, Manuel; Gómez Sánchez, Emilio; Escuela Internacional de Doctorado
    Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la infertilidad es un problema de salud global que afecta a millones de personas en todo el mundo. La infertilidad se define como la incapacidad de concebir tras 12 meses de relaciones regulares sin protección. La prevalencia puede alcanzar el 10,5% de la población española, afectando a unas 900.000 parejas en dicho país. Objetivos Esta tesis se divide en dos diferenciados capítulos, que tienen como objetivo común aumentar el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la reproducción y, por tanto, mejorar el diagnóstico de la infertilidad y las tasas de reproducción asistida. En el primer capítulo se analiza la expresión génica de testículo para comprender los procesos moleculares implicados en el desarrollo del espermatozoide. Para ello, utilizamos un modelo de primate no humano, el babuino (Papio anubis). El segundo capítulo pretende mejorar los métodos de selección embrionaria, basándose en los polimorfismos presentes en genes potencialmente implicados en la implantación y desarrollo embrionario temprano. De esta forma se pretende aumentar las posibilidades de éxito en las transferencias de embriones. Metodología Para abordar el primer capítulo, se utilizaron 8 muestras testiculares, 4 de babuinos inmaduros y 4 de maduros. El estado de madurez se corroboró mediante características anatómicas e histológicas. El ARN de cada muestra se analizó mediante la tecnología RNA-seq. Los resultados obtenidos se procesaron mediante un análisis bioinformático, donde las secuencias se pseudoalinearon con los transcriptomas de referencia (Panubis1.0 y hg38) y se compararon entre los grupos (maduros e inmaduros). Los genes expresados diferencialmente (logFC≥|2| y FDR<0,01) se utilizaron para evaluar su posible papel en la espermatogénesis. En el segundo capítulo, se utilizaron muestras de ADN de 131 embriones, que habían sido sometidos a una biopsia. Por un lado, se diseñó un panel Ampliseq, eligiendo 33 genes relacionados con la implantación y desarrollo gestacional temprano. Con este panel se analizaron todos los embriones y se evaluaron los polimorfismos detectados en función del tipo de mutación, genotipo, localización en el gen, posible fenotipo patogénico y su prevalencia en la población. Por otro lado, se utilizó la tecnología KASP para evaluar los polimorfismos c.677C>T y c.1298A>C del gen MTHFR de todos los embriones transferidos. Los resultados de estos análisis genéticos se compararon con los resultados clínicos tras la transferencia embrionaria. Resultados y conclusiones El análisis transcriptómico RNA-seq de los testículos de babuino anotó un total de 15.297 genes distintos del genoma Papio anubis. El análisis de expresión diferencial entre testículos maduros e inmaduros detectó 2029 genes sobreexpresados y 555 subexpresados en los testículos maduros. Algunos de los nuevos genes que aparecieron en este estudio son SPATA18, SPATC1, TMEM262, ARRDC5, SPATA31D1, TMEM239, LEMD1, FAM187B, C3orf22, C11orf42, TMEM31, TSPAN16, CT83, C7orf61 y SLC9C2. Se detectaron un total de 1897 genes no codificantes, donde destacan SPACA6, LINC00303 y LINC01121. Tras la evaluación de los polimorfismos genéticos de los embriones humanos (panel Ampliseq), se destacaron ARHGAP21, ENG, STAT3, PMM2 y GATA4 como posibles genes implicados en la implantación y desarrollo embrionario temprano, pudiendo ser utilizados como marcadores de selección embrionaria. Se ha detectado un posible efecto deletéreo de las variantes polimórficas homocigóticas chr17:40481601 C>T (STAT3) y chr16:8904956 G>A (PMM2). Además, se ha detectado un posible efecto deletéreo en otras mutaciones no detectadas hasta ahora en la población, incluso en heterocigosis, como chr10:24909241 C>T, chr10:24909164 G>A y chr10:249090 TC>T (ARHGAP21), o chr9:130578295 CAG>C (ENG). No se pudo confirmar la relación entre los polimorfismos del gen MTHFR y el resultado clínico tras la transferencia embrionaria. Sin embargo, se ha descrito por primera vez un embrión portador de la combinación polimórfica c.677TT y c.1298AC del gen MTHFR, que no implantó.
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    Optimization of post-cervical insemination in gilts and development of a new method of deep intra-cervical insemination based on the study of the reproductive system
    (Universidad de Murcia, 2020-12-14) Llamas López, Pedro José; García Vázquez, Francisco Alberto; Escuela Internacional de Doctorado
    La inseminación artificial (IA) ha evolucionado en las últimas décadas desde una IA cervical (CAI) hacia una inseminación más profunda, denominada IA post-cervical (PCAI). Con esta nueva técnica se ha conseguido reducir la concentración espermática en las dosis seminales, obteniendo los mismos resultados productivos que con CAI, lo que conlleva importantes ventajas económicas. Sin embargo, hasta la fecha, PCAI solo se utiliza en cerdas de más de un parto (primíparas y multíparas), pero no es así en cerdas sin ningún parto (cerdas nulíparas). Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue evaluar la validez actual del método PCAI en hembras nulíparas y posibles variantes que mejoren su eficiencia, así como el estudio de otras alternativas basadas en las características anatómicas del cuello uterino de este tipo de cerdas. En el artículo 1, se observó que la eficiencia de los dispositivos actuales de PCAI aplicados en cerdas nulíparas era muy reducida (23.1%) respecto al 95% alcanzado en cerdas multíparas. Las cerdas que no pudieron ser inseminadas en un primer intento fueron sometidas a diferentes tratamientos previos al siguiente intento de aplicación PCAI (Hidrocloruro de Vetrabutina-VC; diluyente atemperado-WE a 44.9 ± 2.1 ºC) con el fin de obtener una relajación de la musculatura presente en el cérvix y facilitar el paso del dispositivo de PCAI. Los resultados mostraron una tasa de éxito para el grupo VC del 34.2% frente al 23.8% del grupo WE. En el siguiente ensayo, se diseñaron dos nuevos dispositivos de PCAI con dimensiones más reducidas adaptadas a las cerdas nulíparas. Un primer dispositivo (GpC1) formado por un catéter multianillas de menor diámetro (16 mm) que el usado en cerdas multíparas, pero con la misma cánula interna. El segundo diseño de dispositivo (GpC2) consistió en el mismo catéter multianillas del grupo GpC1, pero con una cánula interna de menor diámetro (2.5 mm). Los resultados obtenidos mostraron un mayor éxito de aplicación para el grupo GpC2 que para el GpC1 (60.3% vs. 37.0%, p <0.05), pero en ambos casos se mejoró la técnica con respecto al dispositivo PCAI de multíparas. En el artículo 2 se estudiaron las diferencias anatómicas e histológicas entre el aparato reproductor de una cerda multípara y nulípara. Se observó que la longitud del cérvix y la sección transversal del cérvix (parte craneal del útero) en cerdas multíparas era superior que en cerdas nulíparas. En cuanto al análisis histológico del cérvix, se observó un mayor contenido de tejido conectivo y menor cantidad de fibras musculares en cerdas multíparas que en cerdas nulíparas. Además, en el estudio morfológico interno del canal cervical, que se realizó mediante inyección ex vivo de silicona en el cérvix, se observaron diferencias significativas entre cerdas nulíparas y multíparas. En el artículo 3, y en base a los datos obtenidos en los experimentos anteriores, se diseñó un nuevo dispositivo para inseminación en cerdas nulíparas, denominado Inseminación Artificial Profunda-Cervical (Dp-CAI), formado por un catéter cervical multianillas con un diámetro de 17 mm y una cánula interna de 65 cm de longitud y 3 mm de diámetro. Se observó un porcentaje de éxito del 88.9% con el nuevo dispositivo Dp-CAI. En cuanto a los resultados reproductivos, no se observaron diferencias significativas entre las dos metodologías de inseminación (CAI vs. Dp-CAI), aun utilizando dosis seminales reducidas en Dp-CAI. En conclusión, se ha mostrado que existen diferencias anatómicas e histológicas entre cerdas nulíparas y multíparas, lo que dificulta la aplicación de PCAI, por lo que el diseño de nuevos dispositivos de IA cervical profunda adaptados a las cerdas nulíparas reduce la concentración espermática y el volumen de las dosis seminales sin menoscabar en los rendimientos productivos.