Browsing by Subject "Fecundación in vitro"

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    Avances en criopreservación y transferencia no quirúrgica de embriones porcinos = Advances in cryopreservation and non-surgical transfer of porcine embryos.
    (2013-10-04) Gomis Almendro, Jesús; Martínez García, Emilio Arsenio; Cuello Medina, Cristina; Facultad de Veterinaria
    La industria porcina tiene un considerable interés en el uso de la transferencia de embriones, incluyendo la criopreservación de los mismos. Sin embargo, la utilización comercial de la transferencia de embriones en esta especie ha sido muy limitada debido principalmente a la necesidad de utilizar procedimientos quirúrgicos para la obtención y transferencia de los embriones, y a las dificultades encontradas para la criopreservación de dichos embriones mediante los protocolos tradicionales. Últimamente, se han abierto nuevas expectativas para la utilización comercial de esta tecnología gracias al desarrollo de un procedimiento para transferir embriones por vía no quirúrgica y al desarrollo de la vitrificación como método alternativo a los procedimientos tradicionales de criopreservación. El objetivo de esta tesis es mejorar la transferencia vía no quirúrgica de embriones vitrificados-calentados y, desarrollar un protocolo de vitrificación eficiente para los estadios tempranos de desarrollo de embriones porcinos obtenidos, pudiendo aumentar su viabilidad post-calentamiento. Palabras claves: Transferencia de embriones; porcino; Vitrificación; Blastocistos; MEM vitaminas; Forskolin; Delipidación; Desarrollo embrionario; Criopreservación; Cigoto; Embriones de 2 células; Embriones de 4 células; In vivo; Cerdo. Summary The swine industry has a considerable interest for the use of embryo transfer and cryopreservation since these technologies may allow the transport and storage of valuable genetic material with minimal health risks and cost. However, the commercial application of embryo transfer in pig has been traditionally limited due to the need of surgical transfer procedures and the difficulties for long-term storage of pig embryos by using traditional cryopreservation methods. However, new perspectives for embryo transfer and embryo cryopreservation have occurred with the development of a new device, for non-surgical embryo transfer and with the development of vitrification as an alternative to traditional cryopreservation methods. This thesis was designed to improve the non-surgical deep intrauterine embryo transfer procedure with vitrified embryos and develop an efficient and practical vitrification protocol for porcine embryos at very early developmental stages. Keywords: Embryo transfer; Porcine; embryos; Vitrification; Blastocysts; MEM vitamins; Forskolin; Delipidation; Embryo development; Cryopreservation; zygote; 2-Cell embryos; 4-Cell embryos; In vivo; Pig
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    Caracterización de las glicosidasas en el espermatozoide y su papel en la fecundación, con especial énfasis en la especie porcina
    (Universidad de Murcia, 2012-02-07) Ondiz Sánchez, Aitor Domeka de; Ruiz López, Salvador; Avilés Sánchez, Manuel; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Fisiología
    En las especies bovina y porcina se ha comunicado la presencia de glicosidasas ligadas a los espermatozoides (Hayashi et al., 2004). Otros autores han propuesto diferentes glicosidasas espermáticas que interactúan con carbohidratos específicos en la ZP en otras especies animales incluyendo al hombre (Tulsiani et al., 1989, 1990; Avilés et al., 1996; Song et al., 2000; Venditti et al., 2007, 2010).En el presente trabajo se llevó a cabo un estudio de las principales glicosidasas espermáticas para establecer su ubicación en el espermatozoide, el origen de su síntesis, la expresión génica y mediante FIV porcina valorar el papel de aquellas glicosidasas con mayor actividad enzimática (AE) en el reconocimiento de gametos, fecundación y desarrollo embrionario temprano. In bovine and porcine species, the presence of sperm bound glycosidases has been reported (Hayashi et al., 2004). Others studies have proposed different sperm glycosidases that interact with specific ZP carbohydrates in other species, including men (Tulsiani et al., 1989, 1990; Avilés et al., 1996; Song et al., 2000; Venditti et al., 2007, 2010). In the present work, the major sperm glycosidases were studied to establish their localization in the spermatozoon, the origin of their synthesis, their gene expression and through porcine IVF; we sought to define the role of the glycosidases with greater activity during gamete interaction, fertilization and early embryo development.
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    Efecto del medio de fecundación in vitro sobre el patron de reaccion acrosomica en el espermatozoide bovino
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de publicaciones, 2003) Gardón, J. C.; Gadea Mateos, Joaquín; Facultad de Veterinaria
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    Estudio de la composición de los gránulos corticales y del oolema de ovocitos porcinos y bovinos madurados y fecundados in vitro
    (Universidad de Murcia, 2010-01-15) Saavedra Leos, María Dolores; Romar Andrés, Raquel; Avilés Sánchez, Manuel; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Fisiología
    Resumen La polispermia (entrada de más de un espermatozoide al ovocito) es una condición patológica en mamíferos ya que impide el desarrollo embrionario. En la especie porcina, la polispermia es un problema común y aún sin resolver en los sistemas de fecundación in vitro (FIV). Los gránulos corticales (GCs) de los ovocitos de mamíferos estan implicados en el bloqueo de la polispermia, sin embargo, poco se sabe acerca de la composición y función de estas organelas. Esta ampliamente descrito que las moléculas liberadas de los GCs durante la fecundación o activación ovocitaria mediante estimulación química o eléctrica producen importantes modificaciones, particularmente en la zona pelúcida (ZP), el espacio perivitelino y, probablemente, el oolema del ovocito. Estas modificaciones repercuten directamente en el bloqueo de la polispermia. El conocimiento del contenido de los GCs y proteínas del oolema así como su papel durante la fecundación en la especie porcina es escaso. La mayoría de la información que se tiene en la actualidad se ha obtenido del modelo murino. En la presente tesis doctoral, investigamos la presencia de posibles proteínas de los GCs en ovocitos porcinos así como la presencia de metaloproteasas ADAM-10 y ADAM-17 en ovocitos porcinos y bovinos. Para ello, este estudio se dividió en tres apartados: Abstract: Polyspermy (entering of more than a spermatozoon into the oocyte) is a pathological condition in mammals since it avoids the normal embryonic development. In the pig species, Polyspermy is a common problem still unsolved in the current systems of in vitro fertilization (IVF). The cortical granules (CGs) from mammal’s oocytes are involved in the block to polyspermy. However, little is known about the composition and function of these organelles. It is widely described that the molecules released of the CGs during the fertilization or oocyte activation, by means of chemical or electrical stimulation, produce important modifications, particularly in the zona pelucida (ZP), the periviteline space and, probably, oolema of the oocyte. These modifications have a direct role in the block to polyspermy. The knowledge about the content of the CGs and the oolema proteins of as well as their role during fertilization in pigs is still scarce. The majority of the information that we currently have it has been obtained from the murine model. In the present Doctoral Thesis, we investigated the presence of possible proteins of the CGs in pig oocytes as well as the presence of metaloproteases ADAM-10 and ADAM-17 in pig and bovine oocytes. For that, this study was divided into three sections
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    Estudio molecular de la glicoproteína oviductal OVGP1 y su efecto en la fecundación y el desarrollo embrionario in vitro en la especie porcina (Sus scrofa) y bovina (Bos taurus)
    (2016-09-06) Algarra Oñate, Blanca; Avilés Sánchez, Manuel; Jíménez Movilla, María; Facultad de Veterinaria
    Se ha considerado el oviducto como un mero conducto para gametos y embriones durante muchos años, pero numerosos estudios realizados en las últimas décadas han demostrado que está involucrado en importantes procesos que son necesarios para la correcta fisiología de gametos y embriones. Además, el oviducto es el lugar donde tiene lugar la fecundación y el desarrollo embrionario temprano. Gametos y embriones están en contacto con el fluido oviductal (FO) durante su paso a través del oviducto. El FO es un fluido complejo que contiene numerosos compuestos metabólicos y una gran variedad de proteínas. Podemos destacar la proteína oviductal dependiente de estrógenos (OVGP1), también llamada oviductina o mucina-9, como la glicoproteína mayoritaria del FO. Análisis de la secuencia de OVGP1 han mostrado que existe un alto grado de identidad y similitud en el extremo N-terminal de OVGP1 entre las diferentes especies de mamíferos, mientras que el grado de identidad y similitud es bajo en el extremo C-terminal de la misma. La comparación de las secuencias de aminoácidos de OVGP1 entre especies revela la existencia de cinco regiones diferentes (A-E). Todas las proteínas OVGP1 de mamíferos contienen la región A, pero difieren en la presencia/ausencia de otras regiones en el extremo C-terminal. A pesar de la existencia de datos sobre la contribución de OVGP1 en la fisiología reproductiva, todavía no se conoce el mecanismo molecular mediante el que actúa. Por esta razón, en este estudio se realiza una valoración acerca del papel de OVGP1 y su extremo C-terminal en fecundación. Para investigar la función de OVGP1 y su extremo C-terminal, se realizó la clonación de varias proteínas: OVGP1 porcina nativa, OVGP1 de coneja y OVGP1 porcina truncada en la región D y cada una de las regiones A, D y BD de manera individual. Después de la expresión y purificación de las proteínas, fueron utilizadas para realizar ensayos moleculares y fisiológicos. En este trabajo observamos que OVGP1 se unía a la zona pelúcida (ZP) de ovocitos porcinos madurados in vitro (MIV) a través de la región A de su extremo N-terminal y se mostró que su extremo C-terminal modula esta unión, modificando la morfología externa del ovocito. También observamos que la región A no estaba involucrada en la unión especie-específica entre OVGP1 y la ZP. Se detectó OVGP1 en el interior de cuerpos multivesiculares del citoplasma de ovocitos porcinos MIV, sugiriendo la posible endocitosis de la proteína. Por el contrario, la eliminación de la región D del extremo C-terminal impedía la endocitosis. Por otro lado, se ha descrito OVGP1 como el componente del FO responsable del endurecimiento frente a la digestión proteolítica de la ZP. En este trabajo, se mostró que el extremo C-terminal de la proteína es responsable de modular este endurecimiento. Además, se utilizó OVGP1 como suplemento durante la fecundación in vitro (FIV), produciéndose un incremento significativo en el porcentaje de monospermia y en la eficiencia de fecundación, que dependía de la presencia de la región D del extremo C-terminal. De igual manera, se observó un efecto positivo al utilizar OVGP1 como suplemento durante la FIV o el cultivo in vitro (CIV), mientras que al suplementar ambos procesos, el efecto en el rendimiento del sistema bovino era negativo. Por el contrario, esta suplementación en ambos procesos mejoró la calidad de los embriones obtenidos, ya que se detectó un incremento en la expresión de algunos genes relacionados con el desarrollo embrionario temprano. Por todo ello, OVGP1 podría ser un componente idóneo a ser utilizado en los medios sintéticos para mejorar las técnicas de reproducción asistida. Oviducts have long been considered mere conduits for gametes and embryos, but numerous studies performed in recent years have demonstrated that the oviduct is involved in several important processes that are necessary for the correct gamete and embryo physiology. Moreover, the oviduct is the site of fertilization and early cleavage of the zygote. During their trip through the oviductal tube, gametes and early embryos are bathed in oviductal fluid (OF). This complex fluid contains many metabolic compounds and a great variety of proteins. The major non-serum glycoprotein present in the OF is the estrogen-dependent oviductal protein (OVGP1), also named oviductin or mucin-9. Analysis of the sequence shows that the N-terminal region of the mature polypeptide OVGP1 has a high degree of identity and similarity among the species. However, C-terminal regions show a low degree of identity and similarity, with several insertions/deletions in their sequence. Comparison of the amino acid sequences of several mammalian OVGP1 reveals the existence of five different regions (A-E). All mammalian OVGP1 proteins possess region A but differ in the length of the core proteins and therefore the presence/absence of the other regions in C-terminal position. Despite the robust data obtained concerning the contribution of OVGP1 in reproductive physiology in different species, the molecular mechanism that would explain its role remains to be established. For this reason, this study makes a molecular and physiological assessment of the role of OVGP1 and its C-terminal region in fertilization. To investigate the role of OVGP1 and its C-terminal region, several proteins were cloned: full length porcine OVGP1 including regions A, B and D; rabbit OVGP1 including regions A, B and D, wich was almost absent, and porcine OVGP1 which was truncated in the D region. In order to analyze the molecular implications of the different OVGP1 regions, each region of the porcine protein was also cloned. The presence of recombinant protein was confirmed by immunoblot after expression and purification and these proteins were used to carry out molecular and physiological experiments. We showed that OVGP1 were able to bind to the zona pellucid (ZP) of in vitro maturated (IVM) porcine oocytes trought the N-terminal A region of the protein. This study has shown that the A region is not involved in the species-specific binding property when the OVGP1 cross-reactivity between species was analysed. Besides, we showed that C-terminal of OVGP1 modulates the binding to the ZP and the surface morphology of oocyte. OVGP1 was detected within multivesicular-like bodies located inside of the IVM porcine oocytes, suggesting that pOVGP1 was endocytosed by the oocyte. By contrast, deletion of the c-terminal D region prevented OVGP1 endocytosis. Moreover, OVGP1 has been referred to the OF component involved in enzymatic ZP hardening. Here, we proved that OVGP1 C-terminal is responsible for modulating this hardening. Besides, using OVGP1 as a supplementary component in in vitro fertilization (IVF) of the porcine system we noticed a significant increase in the percentage of monospermy and in the fertilization efficiency, whose final output depended on the presence of the carboxy-terminal D region of OVGP1. We also showed that incubation with OVGP1 during IVF or in vitro culture (IVC) had a positive effect in the bovine system, while supplementation in both processes had a negative effect on the final blastocyst output. Nevertheless, such incubation in both IVF and IVC improved embryo quality, because OVGP1 increased the expression of some genes involved in early embryo development. Consequently, OVGP1 would seem to be suitable for incorporation into the synthetic medium to improve assisted reproductive technologies.
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    Fecundación "in vitro" en la especie porcina [Microforma] : análisis de la capacitación y reacción acrosómica
    (Murcia : Universidad, Secretariado de Publicaciones,, 1991) Vázquez Rojas, Juan María
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    Fecundación "in vitro" en la especie porcina [Microforma] : influencia de diferentes condiciones de cocultivo.
    (Murcia : Universidad, Secretariado de Publicaciones,, 1992) Coy Fuster, Pilar
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    Función del sistema plasminógeno-plasmina en la fecundación de ovocitos bovinos y porcinos
    (Universidad de Murcia, 2011-07-13) Grullón Yunen, Luis Alberto; Coy Fuster, Pilar; Romar Andrés, Raquel; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Filosofía
    El objetivo de este trabajo consistió en describir el papel del sistema plasminógeno/plasmina (PLG/PLA) en la fecundación bovina y porcina. Mediante fecundación in vitro, demostramos que la presencia de PLG ó PLA en el medio de coincubación de los gametos disminuía la penetración de los espermatozoides en los ovocitos y su unión a la zona pelúcida (ZP). Esta disminución no se debía a alteraciones de la funcionalidad espermática ni a cambios en la resistencia de la ZP a la proteolisis, sino a que la PLA provocaba la liberación de los espermatozoides adheridos a la ZP. Mediante inmunofluorescencia indirecta detectamos la presencia de PLG y sus activadores en la ZP y en el oolema de los ovocitos antes de la fecundación. Tras la fecundación, dicha presencia disminuyó o desapareció por completo, por lo que proponemos que el sistema PLG/PLA se activa durante la interacción espermatozoide-ovocito y contribuye a regular la polispermia. The aim of this study was to describe the role of the plasminogen/plasmin system (PLG/PLA) in bovine and porcine fertilization. Through in vitro fertilization, we demonstrated that the presence of PLG or PLA in the incubation medium of gametes decreased penetration of oocytes and sperm binding to the zona pellucida (ZP). This decrease was not due to alterations in sperm function or changes in the ZP resistance to proteolysis, but the PLA caused the release of sperm previously bound to the ZP. By indirect immunofluorescence we detected the presence of PLG and its activators in the ZP and oolema of the oocytes before fertilization. After fertilization, this presence diminished or disappeared completely, so we propose that the PLG/PLA system is activated during sperm-oocyte interaction and contributes to the regulation of polyspermy.
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    Mejora de la eficiencia de la transferencia no quirúrgica de embriones frescos de raza pura duroc= Improving the efficiency of non-surgical deep uterine transfer with fresh embryos of purebred duroc sows
    (2014-11-03) Ángel Miñarro, Miguel Ángel; Martínez García, Emilio Arsenio; Gil Corbalán, María Antonia; Facultad de Veterinaria
    La transferencia de embriones debería jugar un crítico papel en los sistemas actuales de producción porcina ya que posibilita el movimiento nacional e internacional de material genético. El objetivo principal de esta tesis fue desarrollar un procedimiento práctico y efectivo de transferencia intrauterina profunda de embriones frescos. En el primer trabajo estudiamos el efecto de dos dosis de eCG para inducir una respuesta superovulatoria en donantes y el rendimiento reproductivo de las receptoras después de la transferencia intrauterina profunda de embriones. En el segundo estudiamos el efecto de la sincronía del ciclo estral en el rendimiento reproductivo de las receptoras. Las transferencias se realizaron en receptoras que salieron en celo 24 h antes o 0 h, 24 h o 48 h después de las donantes. Finalmente, en el tercer estudio se evaluó la transferencia intrauterina profunda no quirúrgica con mórulas producidas in vivo y cultivadas durante 24 h en un medio líquido. En el experimento 1, se estudiaron dos temperaturas y dos medios. En el experimento 2, las mórulas obtenidas se cultivaron en el medio definido a 37 ºC y los blastocistos resultantes de ese se transfirieron a las receptoras. Los resultados de demuestran que el número de donantes para transferir 30 embriones por receptora por vía no quirúrgica se puede reducir mediante los tratamientos de superovulación. Concretamente, una dosis de 1000 UI de eCG es suficiente para obtener unos resultados reproductivos satisfactorios en las receptoras. Los embriones porcinos toleran mejor un ambiente uterino más temprano del que les corresponde cuando son transferidos por vía no quirúrgica en la profundidad de un cuerno uterino. El medio TL-PVA es un medio químicamente definido capaz de mantener una elevada viabilidad in vitro de mórulas porcinas cultivadas a 37 ºC durante 24 h. El rendimiento reproductivo de las receptoras tras la transferencia no quirúrgica en la profundidad de un cuerno uterino reportados en estos estudios representa un avance muy importante para la difusión y comercialización de esta tecnología por la industria porcina. Palabras clave: transferencia de embriones, no-quirúrgica Summary: The use of porcine embryo transfer should play a critical role in pig production because it allows the movement of genetic resources. The main objective of this thesis was to develop an efficient and practical procedure for nonsurgical deep-uterine embryo transfer with fresh embryos. In the first study we evaluated the effect of two doses of eCG to induce superovulation in donor sows and evaluate the reproductive performance of recipients after nonsurgical deep-uterine embryo transfer. In the second study we studied the effect of recipient-donor estrous cycle synchrony on the reproductive performance of recipients. The transfers were conducted in recipients sows that started estrus 24 h before or 0 h, 24 h or 48 h after the donors. Finally, in the third experimental study we evaluated the potential application of non-surgical deep uterine transfers with in vivo-derived morulae cultured for 24 h. In Experiment 1, two temperatures and two media were assessed. In Experiment 2, morulae were cultured in the defined medium at 37 ºC for 24 h, and the resulting blastocysts were transferred to the recipients. The results achieved in these three studies demonstrate that the number of donors needed to nonsurgically transfer 30 embryos per recipient can be decreased and that a dosage of 1000 IU eCG is enough to obtain a satisfactory reproductive performance of the recipients. Porcine embryos tolerate better a less advanced uterine environment if they are nonsurgically transferred deep into a uterine horn. The TL-PVA medium provided a chemically defined medium capable of maintaining a high in vitro viability of porcine morula cultured at 37ºC for 24 h. The excellent reproductive performance of the recipients following NsDU–ETs reported in these three studies represents an important advance for the widespread commercial use of ET by the pig industry. Keywords: embryo tranfer, nonsurgically
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    La simulación del ambiente oviductal modula la capacitación espermática y la fertilidad in vitro en la especie porcina
    (Universidad de Murcia, 2018-02-09) Soriano Úbeda, Cristina de las Mercedes; García Vázquez, Francisco Alberto; Matas Parra, Carmen; Facultad de Veterinaria
    La fecundación es un proceso biológico complejo en el que innumerables factores están directa o indirectamente implicados. Aunque la eficiencia de la fecundación in vitro (IVF) es, en animales sanos, menor que in vivo, en algunas especies de mamíferos como la bovina o la murina se ha alcanzado un alto rendimiento, sin embargo en la especie porcina el rendimiento de la IVF es aún subóptimo. Actualmente, la penetración polispérmica de los ovocitos permanece como uno de los principales obstáculos en la IVF porcina y la simulación de las condiciones in vivo de capacitación espermática y fecundación se postula como la mejor estrategia para mejorar los resultados de IVF. La concentración de bicarbonato (HCO3-), uno de los efectores de la capacitación espermática a través de la activación de la vía de la adenilato ciclasa soluble (sAC)/AMP cíclico (cAMP)/proteína kinasa A (PKA), varía enormemente en los diferentes ambientes que los espermatozoides maduros atraviesan desde la cola del epidídimo (~3-4 mM) al oviducto (de 10 mM en el istmo hasta entre 25 y 90 mM en el lugar de fecundación, dependiendo de la fase del ciclo estral). En el oviducto, la baja concentración de HCO3- en la porción caudal del istmo permite a los espermatozoides permanecer unidos a las células del epitelio oviductal en un estado quiescente y formando el reservorio espermático (SR). Durante la ovulación, acontece un incremento de la concentración de HCO3- que desencadena la hiperactivación del espermatozoide y permite su liberación desde el SR. La secreción de HCO3- provoca un gran incremento del pH en la fase periovulatoria desde aproximadamente 6,5 en el istmo a incluso 8,0 en la ampolla oviductal. El flujo creciente de HCO3- y pH permite el transporte del espermatozoide al lugar de fecundación en la unión ampular-ístmica (AIJ), el desarrollo de la reacción acrosómica (AR) para atravesar las envolturas del ovocito y la penetración. El ambiente oviductal periovulatorio en el que estos fenómenos tienen lugar es bastante diferente de las características in vitro de los medios habitualmente utilizados para la capacitación espermática y IVF, que contienen una concentración de HCO3- estándar de 25 mM y un pH de 7,4. Estos procesos biológicos in vivo tienen lugar en fluidos específicos del tracto genital de la hembra, los fluidos uterino (UF) y oviductal (OF). Sin embargo, la capacitación in vitro y la IVF se producen actualmente en sistemas estáticos en medios químicamente definidos, con diversos grados de complejidad pero con composición y características físicas limitadas (probablemente distantes de las que se encuentran en las secreciones reproductivas), y en tubos o placas de plástico en las que los gametos contactan aleatoriamente, más que por selección y/o competición espermática. Y ninguno de ellos ha sido extendido ampliamente en los laboratorios de reproducción ni han conseguido eliminar el problema de la polispermia. Este trabajo se centra en el efecto que sobre el rendimiento de la IVF tienen factores como la concentración de HCO3- y el pH del medio (pH extracelular, pHe), las secreciones oviductales periovulatorias y un dispositivo en el que los gametos se disponen físicamente separados y los espermatozoides han de nadar para contactar con los ovocitos. En el Capítulo 1, se estudió el efecto de diferentes concentraciones de HCO3- (0, 5, 15 and 25 mM) en la capacitación de espermatozoides maduros y se evaluaron diferentes parámetros de funcionalidad espermática, incluida la fertilidad in vitro. El pHi se incrementó tras la absorción de HCO3-, pero solo concentraciones extracelulares de 15 mM o superiores activaron la cascada de capacitación de cAMP/PKA en el espermatozoide. El tiempo requerido para producir una alta fosforilación de los sustratos de PKA (PKAs-P) fue dependiente de la concentración de HCO3-, dado que con 15 mM fue más tardía que con la concentración habitual de 25 mM. 15 mM de HCO3- también estimuló una motilidad lineal en los espermatozoides y la fosforilación de tirosina (Tyr-P). Para evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides dependiendo de la concentración de HCO3- del medio, se analizaron dos sistemas: i) un sistema de IVF en una fase (IVF monofásica) en la que los espermatozoides se inseminaron directamente sin ningún tratamiento previo y co-cultivados con los ovocitos en un medio de IVF con las diferentes concentraciones de HCO3-, y ii) un sistema de IVF en dos fases (IVF bifásica) en la que los espermatozoides primero se incubaron durante 60 min en un medio capacitante con diferentes concentraciones de HCO3- y después inseminados en un medio de IVF con los ovocitos y la misma concentración de HCO3- que en la preincubación o superior. Los resultados de la IVF monofásica mostraron que 15 mM produjo una eficiencia más alta (26,2%). En la IVF bifásica, la preincubación y IVF a 15 mM alcanzó un 33,9% de zigotos viables (ovocitos penetrados por solo un espermatozoide), lo que resultó en un incremento significativo del 25,3%. El Capítulo 2 combinó un medio con el pH del oviducto durante la fase periovulatoria (pHe 8,0), una mezcla de componentes oviductales periovulatorios formada por secreciones de los COCs, FF y FO periovulatorio (OFCM) y un dispositivo que interpone una barrera física entre los gametos (un tapón de rosca de tubo Falcon® invertido, S) en el que los espermatozoides han de nadar al encuentro con los ovocitos. Los resultados mostraron que el uso combinado de los tres factores estudiados (pHe 8,0, adición de OFCM y el dispositivo S) redujo la polispermia e incrementó la eficiencia final de obtención de zigotos viables a un 48,7% comparado con el sistema clásico a pHe 7,4, carente de OFCM y con el dispositivo W (18,9%). El estudio de la funcionalidad espermática en las condiciones de IVF descritas mostró que tanto pHe como OFCM modulan la capacitación espermática. Los parámetros de motilidad y el estatus de capacitación a través de Tyr-P fue menor a pHe 8,0 y con OFCM. PKAs-P y AR fueron menores en presencia de OFCM, independientemente del pHe. Pudimos concluir que la mayor eficiencia en la IVF con pHe 8,0, presencia de OFCM y el dispositivo S podría ser una consecuencia directa de la acción de los componentes de OFCM sobre los gametos. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que las actuales condiciones subóptimas de la IVF en la especie porcina pueden ser mejoradas simulando el ambiente oviductal periovulatorio in vivo. Ajustando la concentración de HCO3- y el equilibrio ácido-base de los sistemas de IVF porcina, añadiendo fluidos oviductales periovulatorios y utilizando un dispositivo en el que los gametos son ubicados físicamente separados pero con posibilidad de contactar, incrementa la eficiencia de la IVF, reduce la polispermia y se obtiene una alta proporción de zigotos potencialmente viables. A pesar de los innumerables factores, conocidos y no conocidos, que influyen en los procesos de capacitación y fecundación, con este trabajo se muestran nuevas vías hacia la mejora de la IVF en la especie porcina y, probablemente, un nuevo modelo de ART para todas las especies. Fertilization is a complex biological process in which innumerable factors are directly and/or indirectly involved. Although the efficiency of in vitro fertilization (IVF) is, for healthy animals, lower than in vivo, in some mammalian species such as bovine or murine a high yield has been achieved. However, in porcine species the IVF is still suboptimal. Currently, the polyspermic penetration of oocytes remains the main obstacle in porcine IVF, and the in vitro simulation of in vivo conditions of sperm capacitation and fertilization is postulated as the best strategy to improve the IVF output. The concentration of bicarbonate (HCO3-), one of the spermatozoa capacitating effectors which acts through activating the soluble adenylyl cyclase (sAC)/cyclic AMP (cAMP)/protein kinase A (PKA) pathway, varies greatly in the different environments that mature spermatozoa go through from the cauda epididymis (~3-4 mM) to the oviduct (from 10 mM in the isthmus to between 25 and 90 mM in the fertilization site, depending on the stage of the estrous cycle). In the oviduct, the low HCO3- concentration in the caudal portion of the isthmus allows the spermatozoa to remain in a quiescent state, attached to the oviductal epithelial cells and forming the sperm reservoir (SR). At ovulation, there is an increase in HCO3- concentration, which triggers the hyperactivation of spermatozoa that allows their release from the SR. The HCO3- secretion provokes a great increase in pH in the periovulatory phase from around 6.5 in the isthmus and to around 8.0 in the oviductal ampulla. The increasing flow of HCO3- and pH enable the spermatozoa transport to the fertilization site at the ampullary-isthmic junction (AIJ), the development of the acrosome reaction (AR) to penetrate the egg vestments and oocyte fertilization. The periovulatory oviductal environment in which these phenomena take place is quite different from the in vitro characteristics of the medium usually used for sperm capacitation and IVF which contains a standard concentration of HCO3- of 25 mM and pH 7.4. These biological processes in vivo take place in specific fluids of the female genital tract, the uterine fluid (UF) and oviductal fluid (OF). However, in vitro sperm capacitation and IVF are presently produced in static systems in chemically defined media, with diverse grades of complexity but of limited composition and physical characteristics (probably distant from those encountered in the reproductive secretions), and plastic tubes or dishes in which gametes make contact randomly, rather than by selection and/or sperm competition. And none has been widely used in reproduction laboratories or eliminated the great problem of polyspermy in pigs. This work focuses on the effect on IVF of factors such as HCO3- concentration and pH of the medium (extracellular pH, pHe), the effect of periovulatory oviductal secretions and a device in which gametes are located physically separated and spermatozoa must swim to contact the oocytes. In chapter 1, the effects of different HCO3- concentrations (0, 5, 15 and 25 mM) were studied on the capacitation of mature spermatozoa and different functionality parameters were determined, including in vitro fertility. The pHi increased in spermatozoa after HCO3- uptake but only extracellular concentrations of 15 mM and above activated the cAMP/PKA capacitation cascade in the spermatozoa. The time required for the high phosphorylation of PKA substrates (PKAs-P) was HCO3- concentration-dependent, since at 15 mM it took PKAs-P significantly longer than with the usual concentration of 25 mM. 15 mM of HCO3- also stimulated sperm linear motility and tyrosine phosphorylation (Tyr-P). To evaluate spermatozoa fertility according to the HCO3- concentration of the medium, two different IVF systems were contemplated: i) a one-phase IVF system (monophasic IVF), in which spermatozoa were directly inseminated without any previous treatment and co-cultured with the oocytes in an IVF medium with the different HCO3- concentrations, and ii) a two-phases IVF system (biphasic IVF) in which spermatozoa were first pre-incubated for 60 min in a capacitating medium with different HCO3- concentrations and then inseminated in an IVF medium with the oocytes that contained the same or higher HCO3- concentration than in pre-incubation. The results of monophasic IVF showed that 15 mM led to higher efficiency (26.2%) than the rest of concentrations. In the biphasic IVF, both pre-incubation and IVF at 15 mM achieved 33.9% of viable zygotes (oocytes penetrated by only one spermatozoa), which represented in a significant increase of 25.3%. Chapter 2 combined a medium with the pH found in the oviduct during the periovulatory stage (pHe 8.0), a mixture of oviductal periovulatory components formed by COC secretions, follicular fluid and oviductal periovulatory fluid (OFCM) and a device that interposes a physical barrier between gametes (an inverted screw cap of a Falcon® tube, S) in which spermatozoa must to swim towards the encounter with the oocytes. The results showed that the combined use of the three factors studied (pHe 8.0, OFCM addition and S device) reduced polyspermy and increased the final efficiency of viable zygotes obtained to 48.7% compared with the classical system at pHe 7.4, lacking OFCM and a W device (18.9%). The spermatozoa functionality study under these IVF conditions showed that both pHe and OFCM modulate sperm capacitation. The motility parameters and capacitation status through Tyr-P was lower at pHe 8.0 and with OFCM. PKAs-P and AR were lower in the presence of OFCM, independently of the pHe. We concluded that the higher efficiency of IVF with pHe 8.0, in the presence of OFCM and using an S device could be a direct consequence of the action of OFCM components on gametes. The results obtained in this work suggest that the current suboptimal IVF conditions in porcine species can be improved by simulating the in vivo periovulatory milieu in the oviduct. Adjusting the HCO3- concentration and acid-base equilibrium of the porcine IVF systems, adding periovulatory oviductal fluids and using a device in which gametes are located physically separated but with a means of contact, increased the efficiency of IVF by reducing polyspermy and obtaining higher proportion of potentially viable zygotes. Despite the innumerable known and unknown factors that influence the capacitation and fertilization processes we identify new paths towards improving IVF in porcine and probably a new model for ARTs in all species
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    Spermatozoa selection in porcine species : relation with their functionality and in vitro fertilization competence= Selección de los espermatozoides en la especie porcina: relación con su funcionalidad y capacidad de fecundación in vitro
    (2016-01-11) López Úbeda, Rebeca; Matas Parra, Carmen; García Vázquez, Francisco Alberto; Facultad de Veterinaria
    Durante años se ha tratado de simular in vitro el proceso de selección y capacitación espermática que lleva a cabo el tracto genital de la hembra en condiciones fisiológicas, pero los resultados mucho de la selección que ocurre en el oviducto in vivo. El objetivo principal de esta tesis fue: el estudio de las subpoblaciones espermáticas previamente seleccionadas a través de métodos in vitro (por gradientes de Percoll, Capítulo 1; en cultivo de células oviductales, Capítulo 2; y la combinación de ambos sistemas, Capítulo 3), ex vivo (en explantes oviductales, Capítulo 2) e in vivo (en el oviducto de la cerda tras una inseminación artificial, Capítulo 2), y su relación con la funcionalidad y el estado de capacitación, así como su capacidad fecundante. En el Capítulo 1 se analizó la centrifugación mediante gradientes de Percoll como método de selección y capacitación espermática y se evaluó la eficacia en la selección de espermatozoides en función del gradiente utilizado (45/60, 60/75 y 45/90%). En el experimento 1, se analizaron diferentes parámetros espermáticos de las poblaciones obtenidas a través de los 3 grupos experimentales. Los resultados demostraron que al aumentar la diferencia en la densidad del gradiente de Percoll se reduce el número de espermatozoides morfológicamente anormales o con fragmentación del ADN, recuperando principalmente, espermatozoides que han iniciado el proceso de capacitación (95% presentan fosforilación de tirosina en alguna zona). Podemos decir que la separación de espermatozoides mediante gradientes de Percoll se fundamenta en sus diferencias funcionales. En el experimento 2, se emplearon las poblaciones espermáticas en fecundación in vitro para evaluar su capacidad de penetración, y determinar qué gradiente selecciona los espermatozoides más aptos para fecundar y su posible relación con los parámetros estudiados en el experimento 1. Se evaluó el porcentaje de penetración y el número medio de espermatozoides que presentaba cada ovocito. Los resultados mostraron que aquellos espermatozoides obtenidos a partir del gradiente de Percoll más restrictivo (45/90%) dieron lugar a unos mayores niveles de penetración del ovocito. En el Capítulo 2 se estudió el efecto de las células epiteliales del oviducto sobre la capacitación espermática. Se evaluó el estado de capacitación (mediante la distribución de la fosforilación de la tirosina) de los espermatozoides seleccionados mediante células oviductales bajo tres condiciones experimentales: in vitro, ex vivo e in vivo. Los resultados mostraron que existen diferencias entre los espermatozoides unidos o no unidos a las células oviductales, lo que demuestra que este tipo de células seleccionan espermatozoides con bajo grado de fosforilación en tirosina en cualquiera de las condiciones estudiadas. En el Capítulo 3 se estudiaron qué características presentan los espermatozoides para ser seleccionados por las células oviductales y la capacidad de fecundación in vitro de estos espermatozoides doblemente seleccionados [a través de gradientes de Percoll (45/90%) y posteriormente incubados sobre cultivos in vitro de células epiteliales del oviducto]. En el experimento 1 se evaluó la capacidad para fecundar de las dos poblaciones de espermatozoides obtenidas mediante el análisis de diferentes parámetros de fecundación. Los resultados demostraron que los espermatozoides doblemente seleccionados dan mejores resultados de fecundación in vitro, mejorando las tasas de penetración del gameto femenino. En el experimento 2 se analizaron las características funcionales de los espermatozoides. Los resultados indicaron que las células oviductales unen espermatozoides de mayor calidad y realizan su propia selección incluso partiendo de espermatozoides previamente seleccionados. En resumen, los resultados de esta tesis doctoral muestran que las células epiteliales del oviducto son capaces de distinguir aquellos espermatozoides con una capacidad de fecundación superior, lo que en un futuro podría representar un incremento en la eficiencia de los sistemas de reproducción asistida evitando, de este modo, la selección parcialmente subjetiva que existe actualmente en las técnicas convencionales de selección espermática. SUMMARY For many years, attempts have been made to control sperm selection and capacitation in order to simulate under in vitro conditions, but the results are highly variable and are far from in vivo ones. The aim of this thesis was the study of sperm subpopulations that have been previously selected by different methods: in vitro (Percoll gradients in Chapter 1, oviductal cells culture in Chapter 2 and by combining both in Chapter 3), ex vivo (in oviductal explants, Chapter 2) and in vivo (in the oviduct of the sow after insemination, Chapter 2), and their relationship with functionality, sperm capacitation status and fertilizing capacity. In Chapter 1 centrifugation by Percoll gradients was analysed as a sperm selection and capacitation method, and its efficiency for selecting sperm was evaluated. Three different Percoll gradient combinations (45/60, 60/75 and 45/90%) were used. In experiment 1, several parameters related to sperm function were analysed in the different sperm populations obtained through the three experimental techniques. The results of this experiment showed that as the Percoll gradient increased, the number of morphologically abnormal sperm or sperm with DNA fragmentation is reduced, recovering especially those sperm that have begun the process of sperm capacitation (since 95% of spermatozoa present tyrosine phosphorylation in any of the studied areas). So, we can say that the separation of sperm by Percoll gradients is primarily based on their functional differences. In experiment 2, the different sperm populations were used in an in vitro fertilization system to evaluate the penetration rate and checking which Percoll gradient selects the best sperm for fertilization purposes. The penetration rate and the mean number of spermatozoa found in each oocyte were evaluated. The results showed that spermatozoa obtained from the most restrictive Percoll gradient (45/90%) had higher levels of penetration. In Chapter 2 the capacitation status of sperm selected by the oviductal epithelial cells was evaluated (by measuring levels of tyrosine phosphorylation) under three conditions: in vitro, ex vivo and in vivo. The results showed that the phosphorylation pattern changes when sperm are incubated with the epithelial cells of the oviduct, with differences between sperm bound or unbound to the cells. It was concluded that the epithelial cells of the oviduct are able to select spermatozoa with a low level of tyrosine phosphorylation in any of the studied conditions. In Chapter 3 sperm selected by Percoll gradients (45/90%) were incubated with in vitro cultured oviductal epithelial cells. This incubation resulted in two distinct sperm populations: sperm bound to cells and sperm unbound. The study was divided into two experiments. In experiment 1 the ability of the two populations to fertilize was evaluated using different parameters. The results showed that the doubly selected sperm led to better results in the in vitro fertilization systems, significantly improving penetration rates. In experiment 2 the functional characteristics of sperm from the two populations were analysed. The results indicated that the oviductal epithelial cells bind higher quality sperm according to different functional parameters and perform their own sperm selection. In summary, the results of this thesis show that the oviductal epithelial cells are able to distinguish those sperm with a higher fertilization capacity. In the future this could provide an increase in the efficiency of assisted reproduction systems thereby preventing the partially subjective selection that currently exists in conventional sperm selection techniques.