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Caracterización del pulmón como órgano diana de la muerte por sumersión: evaluación del estrés oxidativo y concentraciones de elementos traza
(Universidad de Murcia, 2022-09-28) Barrera Pérez, Estefanía; María Dolores Pérez Cárceles; Agustín Sibón Olano; Escuela Internacional de Doctorado
El diagnóstico de asfixia por sumersión sigue siendo una de las muertes más difíciles y controvertidas de establecer. Representa una de las principales causas de muerte no intencional a nivel mundial. En la mayoría de las ocasiones, el patólogo forense precisa para llegar a un diagnóstico certero, no solo de los hallazgos de autopsia, sino de una serie de pruebas complementarias tales como estudios histopatológicos, biológicos y químicos. A pesar de ser el pulmón el órgano más afectado en la muerte por sumersión, existe poca información sobre el impacto que tiene en este órgano este tipo de muerte. Los objetivos de nuestro trabajo fue investigar la concentración de elementos traza en los pulmones de sujetos que habían fallecido por diferentes causas de muerte para evaluar la capacidad de discriminación de los elementos traza en el diagnóstico de la muerte por sumersión en agua salada. Y conocer los procesos de estrés oxidativo en las muertes por sumersión en agua salada y otras causas de muerte, analizando los niveles de marcadores de estrés oxidativo (MDA y GSH) en lóbulos pulmonares, así como su correlación con alteraciones en la expresión inmunohistoquímica de la proteína A del surfactante pulmonar. Material y métodos: se analizaron un total de 11 elementos traza en 74 casos forenses mediante Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-MS). Para identificar alteraciones ultraestructurales y determinar los niveles de elementos traza en las muestras de pulmón se utilizó microscopía electrónica de barrido asociado a espectroscopia de rayos X de dispersión de energía. Por otra parte, estudiamos en una serie de 93 casos de autopsias forenses, los marcadores de estrés oxidativo mediante determinación colorimétrica de Malondialdehído (MDA), por espectrofotometría el GSH (método de Tiztze). Por último, para evaluar la expresión inmunohistoquímica de la PS-A se realizaron análisis histológicos utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-SPA humano PE-10. Resultados: se obtuvieron concentraciones significativamente más altas de Br y Sr, y concentraciones significativamente más bajas de Cu, Zn, Se, Cd y Pb en los casos de muerte por sumersión en agua salada frente a otras causas de muerte. Estos resultados fueron confirmados por PCA, que reveló una amplia separación entre las muertes por sumersión y el resto de las causas de muerte. Los niveles de MDA fueron superiores en ambos pulmones en los casos de muerte por sumersión en agua de mar en comparación con otras causas de muerte, existiendo diferencias estadísticamente significativas en las concentraciones de MDA entre los tres grupos de causas de muerte analizados. Del mismo modo, se observó niveles significativamente superiores de GSH en los casos de sumersión frente al resto de muertes, resultando ser más significativo en el pulmón derecho. Se obtuvo mayor expresión inmunohistoquímica de la SP-A en los casos de sumersión en agua salada que en las otras causas de muerte, siendo los niveles superiores en ambos pulmones. En el análisis de correlación entre los niveles de estrés oxidativo (MDA y GSH) en tejido pulmonar y el nivel de expresión de la SP-A se obtuvieron resultados positivos y significativos para los casos de sumersión en agua de mar, tanto en membrana alveolar como en el espacio alveolar. Conclusiones: la determinación de los elementos traza Br y Sr en pulmón junto con la determinación de los niveles de MDA y GSH en tejido pulmonar, así como el nivel de expresión de la SP-A puede ser de gran importancia en el diagnóstico de la muerte por sumersión en agua salada y circunstancias de la muerte. Un mejor conocimiento de la fisiología de la sumersión es importante por sus posibles repercusiones en la adopción de medidas en el abordaje de pacientes que han sobrevivido a un proceso de sumersión y también crucial en patología forense para una interpretación más correcta de los acontecimientos que conducen a la muerte por sumersión.
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Caracterización funcional de la tiorredoxina Trxo1 de Pisum sativum y Arabidopsis thaliana : estudio en germinación y bajo condiciones inductoras de estrés oxidativo
(2015-05-22) Ortíz Espín, Ana María; Sevilla Valenzuela, Francisca; Jiménez Hurtado, Ana Mª; Camejo López, Daymi Mercedes; Facultad de Biología
Las tiorredoxinas (Trx) son proteínas pequeñas y ubicuas implicadas en la reducción de los enlaces disulfuro de sus proteínas diana. El grupo de las Trxs está organizado en distintas clases. Los animales cuentan con sólo dos tipos, una citoplasmática y otra mitocondrial. En plantas hay, al menos, diez familias de TRXs con más de 40 miembros presentes en casi todos los compartimentos celulares. En mitocondrias vegetales sólo se han descrito dos tipos de Trxs; la Trxh en álamo (Populus) y la Trxo1 en Arabidopsis (A. thaliana) y guisante (Pisum sativum), donde ha sido también co-localizada en el núcleo. En esta Tesis hemos llevado a cabo diferentes aproximaciones experimentales con el fin de estudiar con detalle algunas de las posibles funciones de la Trxo1 en células vegetales. En primer lugar, hemos identificado posibles proteínas diana nucleares de PsTrxo1 a través de la utilización de técnicas de cromatografía de afinidad. La identificación de la proteína PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) y el componente regulador de rutas de ácido abcísico, el receptor de pirabactina 1 (PYR1) establece nuevas funciones para la PsTrxo1 relacionadas con la síntesis de ADN, ciclo celular, metabolismo hormonal y respuesta al estrés. Otra de las funciones descubiertas para esta Trxo1 durante esta Tesis ha sido su papel durante la germinación de la semilla de Arabidopsis. Ensayos de expresión de AtTrxo1 han señalado un alto nivel durante la germinación, particularmente en el embrión de las semillas sugiriendo un papel para AtTrxo1 durante la movilización de reservas en este proceso. Además, ensayos de germinación mostraron que las semillas del mutante KO AtTrxo1 germinaban antes que las semillas silvestres (Wt) en condiciones salinas, si bien, bajo condiciones estándar de crecimiento, ambos genotipos germinaban y se desarrollaban normalmente sugiriendo la importancia de la Trxo1 en el proceso germinativo y la adaptación a la salinidad. La escasa información relativa a la regulación transcripcional de las Trxs vegetales nos condujo en la búsqueda de elementos cis-trans en el promotor de AtTrxo1. Para ello, se realizaron estudios filogenéticos donde se identificaron seis elementos en cis-funcionalmente relevantes que fueron validados por ensayos de β-glucuronidasa. Posteriormente, los ensayos de un híbrido en levadura nos permitieron identificar más de 30 factores de transcripción pertenecientes a seis familias diferentes como posibles reguladores de la expresión de AtTrxo1. Entre ellos, bZIP9 mostró una fuerte interacción con pAtTrxo1 y se comportó como un posible regulador positivo de AtTrxo1, mientras que AZF2, un factor de dedo de zinc fuertemente relacionado con la respuesta a salinidad, se mostró como un posible represor. Finalmente, se iniciaron estudios de muerte celular. Para ello, utilizamos cultivos de células TBY-2 que sobre-expresaban PsTrxo1 y H2O2 como un inductor de PCD (Programmed Cell Death). La respuesta de las células dependió de la intensidad del tratamiento aplicado. Una concentración 15 mM H2O2 provocó una ligera disminución en la viabilidad del cultivo celular sin diferencias entre líneas. Sin embargo, concentraciones superiores a 35 mM causaron un efecto diferenciador sobre la viabilidad de ambas líneas y la línea sobre-expresante murió varios días después que la línea control. En este sentido, las células sobre-expresantes presentaron un menor estrés oxidativo y diferentes marcadores de PCD que justificaron el retraso observado en la muerte celular. En conclusión, estos resultados podrían sugerir la implicación de PsTrxo1 en la tolerancia de TBY-2 a un tratamiento con H2O2 y en el proceso de muerte celular desarrollado en estas condiciones. ABSTRACT Thioredoxins (Trxs) are ubiquitous small proteins involved in the reduction of disulfide bonds of target proteins. Trxs´ group is organized in different types. Animals contain only two types, one cytoplasmic and one mitochondrial. In plants there are at least ten families of Trxs with more than 40 members present in almost all the cellular compartments. In plant mitochondria only two types of Trx have been described, Trxh found in Populus and Trxo1 type in Arabidopsis (A. thaliana) and pea (Pisum sativum), where it has been also co-localized in the nucleus. In this thesis we have carried out different experimental approaches in order to study in greater depth some of the possible functions of the Trxo1 in plant cells. Firstly, we have identified specific potential nuclear targets of PsTrxo1 using affinity chromatographic techniques. The identification of PCNA protein (Proliferating Cell Nuclear Antigen) and the pyrabactin resistance 1 (PYR1) regulatory component of abscisic acid (ABA) receptor establishes new functions of PsTrxo1 related to DNA synthesis, cell cycle, hormonal metabolism and stress response. The role of Trxo1 in seed germination has been studied in this Thesis. Expression assays of AtTrxo1 pointed out a high level during germination, particularly in seeds embryo suggesting the feasible role of AtTrxo1 in storage proteins mobilization occurring in this process. In addition, germination tests showed that mutant seeds (KO AtTrxo1) germinated earlier than wild type seeds (Wt) in saline conditions, although under standard growth conditions, both genotypes germinated and developed normally, suggesting the importance of Trxo1 in germination and adaptation to salinity. The scarce information on the transcriptional regulation of plant Trxs led us to search cis-trans elements in the promoter of AtTrxo1. For this purpose, phylogenetic studies were done and six cis-functionally relevant elements were found. These elements were validated performing tests of β-glucuronidase. Subsequently, one hybrid assays in yeast allowed us to identify more than 30 transcription factors belonging to six different families showed as feasible regulators of AtTrxo1 expression. Among them, bZIP9 showed a strong interaction with pAtTrxo1 and it was identified as a positive regulator, while AZF2, a transcription factor strongly related with salinity response, was identified as a feasible AtTrxo1 repressor. Finally, we initiated different studies on the possible involvement of Trxo1 in cell death. We used overexpressing PsTrxo1 TBY-2 cell cultures and H2O2 as a PCD (Programmed Cell Death) inductor. The response of cells depended on the severity of the treatment. A concentration of 15 mM H2O2 caused a slight decrease in the viability of the cell culture with no differences between control versus overexpressing line. However, concentrations above 35 mM caused a differentiating effect on the viability and the over-expressing line died several days after the control line. In this situation, over-expressing cells presented lower oxidative stress and several PCD markers justifying the observed delay in cell death. In conclusion, these results could suggest the involvement of PsTrxo1 in TBY-2 of H2O2 treatment and in the cell death process developed in these conditions.
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Efectividad de la suplementación nutricional con polifenoles sobre el daño muscular y marcadores de estrés oxidativo en diferentes tipos de ejercicios físicos: Una revisión dela literatura
(Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 2022) Donadio, Pedro; Muñoz, Cristobal; Flores-Lucero, Francisca; Garcia-Diaz, Diego F.; Farias-Valenzuela, Claudio; Quezada, Esteban; Poblete-Aro, Carlos
Durante la realización de ejercicio, existe un desbalance redox que aumenta las especies reactivas de oxígeno generando un estrés oxidativo que favorece el daño muscular incidiendo en el rendimiento físico y deportivo. Diferentes suplementos antioxidantes han sido utilizados para optimizar la recuperación muscular posterior a la realización de ejercicio físico. Sin embargo, los efectos de diversos antioxidantes han sido contraproducentes, ya que las especies reactivas de oxígeno generadas por el ejercicio son necesarias para la adaptación muscular y la disminución de éstas,impide la correcta señalización intracelular y con esto,la adaptación del músculo esquelético frente al ejercicio físico. Los polifenoles son un tipo de antioxidantes que están presentes en diversos frutos y extractos de hierbas que poseen diversas características dependiendo de su estructura y composición, presentando algunos una ruta deseñalización celular similar al ejerciciofísico, generando diferentes estímulos a nivel del músculo esquelético, pudiendo reducir el daño oxidativo generado por el ejercicio e incluso, pudiendo potenciar sus efectos. El objetivo de la presente revisión ala literatura es determinar y describir el efecto de diversos polifenoles en el daño muscular y marcadores de estrés oxidativo posterior a diferentes modalidades de ejercicio físico y deportes en adultos.
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Efecto protector el té blanco frente al estrés oxidativo agudo en ratas: mecanismo genéticos y moleculares
(2015-07-27) Espinosa Ruiz, Cristóbal; López Jiménez, José Ángel; Pérez Llamas, Francisca; Facultad de Medicina
Antecedentes: Las propiedades beneficiosas del té (Camelia sinensis) son ampliamente conocidas. El té posee una gran capacidad antioxidante debida la presencia de polifenoles denominados catequinas. Estas catequinas poseen diversas propiedades que le permiten ejercer ciertos efectos de protección contra agentes oxidantes más allá de su capacidad antioxidante. Existen pocos estudios realizados a largo plazo y que, además, sean realizados con dosis similares a las que se ingieren normalmente en la sociedad. El factor de trascripción NRF2, se encuentra en el citoplasma unido a un represor (KEAP1) del cual se separa en condiciones de estrés oxidativo y penetra en el núcleo activando una serie de genes de respuesta antioxidante (respuesta ARE) entre los que se incluyen diversas enzimas antioxidantes y detoxificantes. Existen estudios que sugieren que algunas catequinas podrían activar esta respuesta. La adriamicina es un antibiótico de la familia de las antraciclinas, aislado de Streptomices peucetis hace más de 50 años. Posee la capacidad de detener la división celular, y por ello es utilizado contra una gran variedad de canceres y tumores. También tiene una gran capacidad de generar radicales libres in vivo. Los pacientes tratados con esta sustancia sufren daños en todos los órganos, en especial en el corazón debido a que esta molécula tiene gran afinidad con la cardiolipina. Se han realizados numerosos estudios para intentar neutralizar los efectos secundarios de este fármaco, con el fin de aumentar la supervivencia de los pacientes e incrementar la calidad del tratamiento. Objetivos: Por ello se pretende estudiar los efectos de la ingesta de té, así como la capacidad que posee el mismo para proteger a los tejidos de una situación de estrés oxidativo agudo. Materiales y método: Para ello, realizaremos primero un estudio en ratas de la raza Sprague Dawley en jaulas metabólicas que analice las posibles interferencias con la dieta de una ingesta continuada de té blanco. Posteriormente, comenzaremos con un tratamiento con diferentes dosis de té blanco (0, 15 y 45 mg de extracto de té blanco/kg de peso corporal al día que equivalen a 0, 4 y 12 mg de polifenoles /kg de peso corporal al día) en el agua de bebida. Tras 12 meses de tratamiento se administran a todas las ratas (excepto a la mitad de los animales control a los cuales se les inyecta solución salina) una inyección intraperitoneal de adriamicina (10mg /kg de peso corporal). Tras 48 horas se anestesian los animales se sacrifican obteniéndose muestras de sangre y tejidos (hígado, corazón, cerebro y riñón). Se obtuvo la fracción microsomal de algunos de ellos (hígado, corazón y cerebro) y el plasma. Se realizaron diferentes análisis: como la medición de la actividad antioxidante, los grupos carbonilo e hidroperóxidos. Además, se realizó un análisis de expresión génica en hígado y riñón de genes relacionados con el NRF2 y enzimas detoxificantes y antioxidantes. Se midieron también la actividad de las enzimas antioxidantes. Se realizaron también análisis en los perfiles de ácidos grasos del corazón y el hígado. Resultados y discusión: El té no interfiere en la eficiencia alimentaria de las ratas estudiadas, solo se encontró una ligera disminución en la absorción del Fe. Por otro lado, los resultados indicaron que la ingesta a largo plazo de té blanco protegió contra los efectos oxidantes de la adriamicina en todos los tejidos y órganos analizados activando además la repuesta ARE vía NRF2 en el hígado y no siendo necesaria la activación de la misma en el riñón. Estudios adicionales son necesarios para comprender todos los mecanismos implicados en la respuesta frente a un agente como la adriamicina. No se encontraron diferencias en los perfiles de ácidos grasos. Background: The beneficial properties of tea (Camellia sinensis) are widely known. The tea has a high antioxidant activity due the presence of polyphenols called catechins. Catechins have various properties that allow you to exert some protective effects against oxidizing agents beyond their antioxidant capacity. There are few long-term studies and also are made with doses similar to those normally consumed in society. The transcription factor Nrf2 is located in the cytoplasm bound to a repressor (KEAP1). This union is separated in conditions of oxidative stress and NRF2 enters the core by activating a series of antioxidant response genes (ARE) between those included various antioxidant and detoxifying enzymes. Studies suggest that some catechins could activate this response. Adriamycin is an antibiotic of the anthracycline family, isolated from Streptomyces peucetis over 50 years. It has the ability to stop cell division and therefore is used against a variety of cancers and tumors. It also has a great ability to generate free radicals in vivo. Patients treated with this substance suffer damage in all organs, especially the heart because adriamycin has great affinity with cardiolipin. Numerous studies have been undertaken to try to counteract the side effects of this drug, in order to increase patient survival and increase quality of treatment. Objectives: The aim of the present thesis is to study the different effects of white tea intake, and the ability to possess the same to protect tissues from a situation of acute oxidative stress. Matherials and method: With this purpose, we studied Sprague Dawley in metabolic cages to analyze the potential interference with an ongoing dietary intake of white tea. Later, we began a treatment with different doses of white tea (0, 15 and 45 mg of extract of white / kg body weight tea a day, equivalent to 0, 4 and 12 mg of polyphenols / kg of body weight per day) in the drinking water. After 12 months of treatment all rats was administered (except to half of control animals which are injected with saline) with an intraperitoneal injection of adriamycin (10mg / kg body weight). After 48 hours the animals are anesthetized and sacrificed, obtaining samples of blood and tissues (liver, heart, brain and kidney). The microsomal fraction of some organs (liver, heart and brain) and plasma was obtained. Different analyzes were realized: as antioxidant activity, hydroperoxides and carbonyl groups. Furthermore, gene expression in liver and kidney related NRF2 and detoxifying enzymes and antioxidant genes was measured. The activity of antioxidant enzymes was also analyzed. The fatty acid profiles of the heart and liver were measured. Results and discussion: Tea not interferes with the feed efficiency of the rats studied; we only found a slight decrease in the Fe absorption. Moreover, the results indicated that the long term intake of white tea protected against oxidative effects of adriamycin in all tissues and organs analyzed further activating ARE via NRF2 response in the liver and not activating it being necessary kidney. Additional studies are needed to understand all the mechanisms involved in the response to an agent such as adriamycin. No differences in fatty acid profiles were found.
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Effect of long term intake of white tea on acute oxidative stress in rats
(2015) Espinosa Ruiz, Cristóbal; González Silvera, D.; Pérez Llamas, Francisca; López Jiménez, José Ángel; Zamora Navarro, S.; Fisiología
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Especies reactivas de oxígeno y su implicación en Biomedicina
(Universidad de Murcia. Servicio de publicaciones, 2018) Lozano Picazo, Carmen María; Fernández-Belda, Francisco
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) actúan como regulador intracelular cuando se generan de forma controlada en puntos concretos de la célula. Modifican la función de proteínas mediante la oxidación reversible de cisteínas. Hay quinasas y fosfatasas de proteínas, factores de transcripción y canales iónicos que están regu-lados por ROS. Estrés oxidativo y daño celular aparecen cuando los mecanismos antioxidantes de protección son incapaces de mantener bajo el nivel intracelular de ROS. En estas condiciones, ROS inducen pérdida de viabilidad celular en patologías degenerativas de corazón y cerebro y promueven proliferación celular ilimitada en procesos tumorales. La alteración de la función mitocondrial juega un papel clave en la generación del estrés oxidativo y por tanto es una diana terapéutica preferente para evitar o aminorar los daños oxidativos producidos por ROS.
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Estrategias de intervención en precosecha y postcosecha para mejorar la calidad y prolongar la vida útil de "hojas jóvenes" en IV gama
(2016-09-16) Garrido Hernández, Yolanda Esperanza; Gil Muñoz, Mª Isabel; Facultad de Biología
Los nuevos hábitos de consumo y la mayor preocupación por una alimentación sana y saludable han impulsado el lanzamiento a nivel mundial de las ensaladas de ‘hojas jóvenes’, como una combinación de hojas de variedades seleccionadas por su pequeño tamaño, de textura tierna, apariencia exótica y que suponen una fuente natural de constituyentes beneficiosos para la salud. A pesar de ser considerados productos de alto valor añadido, no satisfacen las expectativas del mercado por ser un producto muy perecedero cuya calidad es difícil de mantenerse durante la conservación. La investigación descrita en esta tesis tiene como objetivo profundizar en el conocimiento de algunas de las causas precosecha y postcosecha que contribuyen a la pérdida de calidad de las ensaladas de ‘hojas jóvenes’. En estos trabajos se han estudiado los mecanismos de acción con una investigación básica relacionada con la biología de la hoja mediante el análisis de parámetros relacionados con su fisiología, histología, bioquímica y microbiología, así como su efecto en la calidad sensorial y nutricional del producto envasado, junto con elementos más tecnológicos y de aplicación industrial como la comparación de los sistemas de enfriamiento y el estudio de distintas atmósferas modificadas en el envasado. Se ha estudiado el cultivo de lechugas ‘multi’ con distintas condiciones salinas cultivadas en sistema sin suelo y su influencia en la fisiología y calidad del producto. La salinidad produjo cambios estructurales en las hojas que pueden estar relacionados con una mayor resistencia física de la hoja, con el incremento en concentración de solutos, la elasticidad de la hoja y la compactación de sus tejidos. El estrés salino también aumentó el contenido en compuestos fenólicos aunque afectó negativamente a la calidad visual de la hoja y al rendimiento. A su vez, se ha evaluado en espinaca ‘baby’ la influencia del momento de recolección comparando la recolección en la mañana, mediodía y tarde así como distintos períodos de retraso hasta el procesado en la calidad del producto procesado. En base a los resultados obtenidos, en invierno las hojas de espinaca ‘baby’ podrían ser cosechadas en cualquier momento del día, mientras que en primavera los resultados obtenidos mostraron que a primera hora de la mañana es la mejor hora del día para su recolección. La cosecha de primera hora del día presentó un mayor contenido en agua y firmeza y mejor calidad visual a lo largo de toda la conservación del producto procesado. Además, los resultados mostraron que las hojas de espinaca ‘baby’ pueden tolerar un retraso hasta su procesado de al menos 48 horas sin presentar síntomas evidentes de pérdida de calidad. Además se evaluó el efecto en espinaca ‘baby’ de distintos sistemas de pre-enfriamiento de uso industrial. La etapa de pre-enfriamiento tuvo una mayor influencia en la mejora de la calidad del producto en la cosecha de primavera que en la de invierno. Los sistemas de pre-enfriamiento por vacío y por ducha con agua fría mejoraron la viveza del color y la hidratación de las hojas, destacando como sistemas más eficaces comparados con el enfriamiento en cámara convencional y por aire forzado. Sin embargo, el enfriamiento por vacío redujo la calidad visual de las hojas debido al aumento en la fragilidad. A su vez, se ha analizado el efecto de diferentes exposiciones a la luz durante la conservación de espinaca ‘baby’ tanto bajo condiciones de atmósfera modificada (MAP) como de atmósfera controlada (AC). Los resultados muestran que el producto conservado en MAP en oscuridad alcanza en el interior del envase altos niveles de CO2, mientras que en luz se alcanzan altos niveles de O2 debido al balance entre los procesos fotosintéticos y respiratorios. La exposición a distintas condiciones de luz no afectó a ninguno de los parámetros evaluados en el producto procesado conservado en AC. Los resultados muestran que los cambios observados se deben principalmente al efecto de la atmósfera de conservación y no al efecto directo de la exposición a la luz. Altos niveles de O2 promovieron el daño oxidativo de las hojas y el crecimiento bacteriano, mientras que altos niveles de CO2 aumentaron el pH de producto y ocasionando daños en el tejido, por lo que se recomiendan niveles intermedios de O2 y CO2 durante la conservación de brotes de espinaca. Los resultados generales obtenidos en esta tesis han permitido profundizar en el conocimiento de la fisiología y tecnología postcosecha desde la pre-cosecha a la postcosecha, con especial interés en las fases de recolección, acondicionamiento tras la recolección, procesado y conservación de ‘hojas jóvenes’ en IV Gama. SUMMARY The new consumer habits and increased concerns about healthy food have promoted the worldwide release of baby leaf salads, as a combination of leaves from selected varieties because of their small size, tender texture and exotic appearance, which represent a natural source of beneficial constituents. Despite being considered high added valued product, they do not satisfy market expectations because of the high perishability and quality loss. The research described in this thesis aims to deepen in the knowledge of some of pre-harvest and post-harvest factors that affect quality of fresh-cut baby leaves. In this thesis, the mechanisms of quality loss has been analyzed from a basic research approach related to the leaf biology by analyzing parameters related to physiology, histology, biochemistry and microbiology, as well as the effect on sensory and nutritional quality of the packaged product. In addition, some technological and industrial application elements have been studied such as the impact of different cooling systems and modified atmosphere packaging. Multi-leaf lettuce cultivated with different salinity conditions in soilless system has been studied, particularly related to the influence on physiology and product quality. Salt stress produced structural changes in leaves related to higher leaf strength, with an increase in solute concentration, leaf elasticity and tissue compaction. Salt stress also led to higher phenolic compound content, although with a detrimental effect in leaf visual quality and crop yield. Moreover, the effect of time of day for harvest and the delay before processing have been evaluated on the quality characteristics of minimally processed baby spinach. Results showed in this study suggest that baby spinach for minimal processing could be harvested at any time in winter, while in spring it is recommended to harvest early in the morning. Baby spinach harvested early in the morning showed higher water content, firm texture and good visual quality during storage. In addition, results showed that baby spinach can tolerate a delay before processing of at least 48 h without showing evident symptoms of quality loss. Additionally, it has been evaluated the effect of different industrial precooling systems for minimally processed baby spinach. Hydro cooling and vacuum cooling are the precooling systems that improved colour vividness and leaf water content, and they stand out as more effective systems compared to room cooling and forced air cooling systems. However, vacuum cooling reduced the visual quality of the leaves due to the increase in leaf fragility. Moreover, the effect of different light exposures during storage of baby spinach under modified atmosphere (MAP) and controlled atmosphere (CA) has been studied. The results in MAP conditions showed that the product stored under darkness reached higher levels of CO2 within the bags, while under light condition reached higher levels of O2 due to the balance between photosynthesis and respiration reactions. The different conditions under light exposure did not affect any of the quality parameters evaluated in the processed product stored in CA. The results of this study showed that the changes observed were mainly due to the effect of gas composition and not due to the direct effect of light exposure. Higher levels of O2 promoted an oxidative damage and microbial growth of the leaves, while higher levels of CO2 increased pH of the product and caused tissue damage. Therefore, moderate levels of O2 and CO2 were recommended for minimally processed baby spinach during storage. The overall results obtained in this thesis have allowed to deep in the knowledge of physiology and postharvest technology from pre-harvest to post-harvest stages, with special interest of some factors such as harvesting, postharvest handling, processing and storing of baby leaf salads.
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Estudio metabolómico y de marcadores de estrés oxidativo y función vascular en pacientes sometidos a trasplante renal
(2017-07-17) Heras Gómez, Ignacio de las; Gil Izquierdo, Ángel; Casas Pina, María Teresa; Medina Escudero, Sonia; Escuela Internacional de Doctorado
Objetivo Estudiar la fisiopatología del riñón trasplantado y su función en los seis meses postrasplante con respecto a su estrés oxidativo y estado inflamatorio, prestando especial atención a la evolución de los marcadores de estrés oxidativo y función vascular, y buscando entre ellos posibles predictores precoces de rechazo agudo del órgano trasplantado. Metodología Estudio longitudinal prospectivo realizado en el periodo comprendido entre Octubre de 2013 y Mayo de 2015, en el cual se incluyeron 60 pacientes trasplantados de riñón de donante cadáver en la Unidad de Nefrología del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca y en el que se estudió su función renal y su estado inflamatorio y oxidativo en seis momentos diferentes de los seis primeros meses postrasplante. Además se incluyeron 60 sujetos sanos como grupo control. Los marcadores bioquímicos se analizaron en muestras de sangre y orina mediante métodos colorimétricos y turbidimétricos, y los marcadores de estrés oxidativo y función vascular en muestras de orina mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Resultados Se observó una diminución del estrés oxidativo y del estado inflamatorio según avanzaba la fase postrasplante, encontrándose niveles de metabolitos de lipoperoxidación elevados en los pacientes trasplantados con respecto a los sujetos sanos en todos los momentos del estudio. Se halló una correlación directa entre algunos de los marcadores de estrés oxidativo analizados y la proteinuria, observándose que según disminuía la excreción de proteínas urinarias mejoraba el filtrado glomerular. Así mismo, se observó una correlación directa entre la proteinuria y los niveles urinarios de prostanoides. Aquellos pacientes que presentaron retraso en la función inicial tuvieron una peor función renal durante todo el estudio, con un aumento de la excreción urinaria de proteínas y, consecuentemente, de metabolitos de lipoperoxidación. Tanto la edad del donante como el tiempo de isquemia fría del órgano trasplantado se correlacionaron negativamente con el filtrado glomerular, encontrándose en ambos casos un aumento de la proteinuria y de la excreción de eicosanoides. Conclusiones La inflamación y el estrés oxidativo disminuyeron en los seis primeros meses posteriores al trasplante. A pesar de ello, se encontraron elevados en los pacientes trasplantados con respecto a los sujetos sanos del grupo control en todos los momentos del estudio. La disminución del estado inflamatorio y del estrés oxidativo en los pacientes trasplantados se vio acompañado de un aumento del filtrado glomerular estimado y una disminución de la proteinuria. Además, se halló una correlación directa entre la excreción de proteínas urinarias y la excreción de metabolitos de lipoperoxidación, hecho que nos indica el aumento de estrés oxidativo al aumentar la carga de proteínas en la nefrona y que desencadena un deterioro de la función renal. Entre los 26 metabolitos de peroxidación lipídica analizados, los que mejor correlación presentaron con la proteinuria y que podrían emplearse como marcadores de daño renal tras el trasplante son los siguientes: a. Isoprostanos: 8-iso-15(R)-PGF2α; 15-epi-15F2t; 5-F2t; 5-epi-5-F2t; 8-F3t b. Neuroprostanos: 4-epi-4-F3t-NeuroP Objective To study the physiopathology of a transplanted kidney and its function in a six-month post-transplantation with respect to its oxidative stress and inflammatory condition, paying special attention to the evolution of oxidative stress and vascular function markers and looking for possible early predictors of an acute rejection of the transplanted organ. Methodology A prospective longitudinal study, conducted between October 2013 and May 2015, which included 60 kidney transplant patients from deceased donors in the Nephrology Unit of the Virgen de la Arrixaca Clinical University Hospital. The study examined their renal function as well as their inflammatory and oxidative condition at six different times during the first six months after transplantation. Additionally, 60 healthy individuals were included as a control group. Biochemical markers were analyzed with blood and urine samples by using colorimetric and turbidimetric methods; oxidative stress and vascular function markers were analyzed with urine samples by using mass spectrometry. Results There was a decrease in the oxidative stress and inflammatory condition as the post-transplant phase progressed, with high levels of lipid peroxidation and prostanoids in transplant patients at all times during the study compared to those of healthy individuals. There was a direct correlation between some of the oxidative stress markers analyzed and the proteinuria since the glomerular filtration improved when the excretion of urinary proteins decreased. There was also a direct correlation between proteinuria and urinary prostanoid levels. Those patients who presented a delay in the initial function had worse renal function throughout the study, with an increase in the urinary excretion of proteins and, consequently, of lipid peroxidation and inflammatory prostanoids. Both the age of the donor and the cold ischemia time of the transplanted organ were negatively correlated with the glomerular filtration, with an increase in the proteinuria and the excretion of eicosanoids in both cases. CONCLUSIONS Inflammation and oxidative stress decrease in the first six months after transplantation. Despite this fact, their levels were high in transplant patients at all times during the study compared to those of the healthy individuals of the control group. The reduction of the inflammatory condition and the oxidative stress in transplant patients was accompanied by an increase in the estimated glomerular filtration and a decrease in proteinuria. There was also a direct correlation between the excretion of urinary proteins and the excretion of lipid peroxidation, which indicates the increase of oxidative stress when increasing the protein load in the nephron and triggers a deterioration of the renal function. Among the 26 lipid peroxidation metabolites analyzed, those which are best correlated with proteinuria that could be used as kidney damage markers after transplantation are the following: a. Isoprostanes: 8-iso-15(R)-PGF2α; 15-epi-15F2t; 5-F2t; 5-epi-5-F2t; 8-F3t B. Neuroprostanes: 4-epi-4-F3t-NeuroP
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Evaluación clínico patológica y biomarcadores de estrés oxidativo en pacientes con liquen plano oral
(2014-01-30) Pons-Fuster López, Álvaro; López Jornet, María Pía; Facultad de Medicina
Introducción El liquen plano oral (LPO) es probablemente la enfermedad no infecciosa más frecuente de la mucosa oral .La prevalencia del liquen plano en la población general se estima entre un 0’2 y un 1’9%. En la actualidad, se considera que la LPO es un proceso inmunológico multifactorial con factores genéticos, psicológicos, infecciosos, etc., que podrían actuar como agentes causales o como precipitantes del proceso. Las manifestaciones clínicas se presentan como patrones (erosivos) ulcerosos, atróficos, reticulares, papulares y en placas. La posible malignización del liquen plano oral (LPO) sigue en la actualidad como un tema de controversia, este riesgo de malignización del liquen plano oral sugiere la realización de nuevas investigaciones a fin de determinar los factores involucrados en este proceso. Objetivos. Los objetivos fueron realizar un estudio clínico de las lesiones de liquen plano oral su asociación con enfermedades autoinmunes e investigar condiciones de estrés Oxidativo en saliva Material y Métodos Se seleccionaron 130 pacientes con liquen plano oral que cumplen los criterios de inclusión .En los 130 pacientes de LPO diagnosticados clínica e histopatologicamente se encontró que el tipo clínico de presentación más frecuente fue el reticular. Resultados Existe una asociación estadísticamente significativa entre la forma de presentación y la sintomatología referida por el paciente . La lesión reticular es la forma más frecuente de LPO que aparece como una red de estrías blancas superpuestas, seguidas de patrones (erosivos) ulcerosos, atróficos y placas. Encontramos la presencia de mayor numero de enfermedades autoinmunes 0.07% (10 /130) en pacientes con OLP que en que el grupo control 0,04% (6 /130) Encontramos, la correlación negativa significativa entre la saliva capacidad antioxidante total y los niveles de MDA en LPO. Conclusión Encontramos la presencia de mayor numero de enfermedades autoinmunes en pacientes con OLP que en que el grupo control.Encontramos, la correlación negativa significativa entre la saliva capacidad antioxidante total y los niveles de MDA en LPO. ABSTRACT Oral Lichen planus (OLP) is probably the most common non-infectious disease of the oral mucosa. Lichen planus prevalence in the general population is estimated between 0.2 and 1.9%. At present, it is considered that the LPO is a multifactorial immune process with genetic, psychological, infections factors which could act as causal agents or as precipitating the process. The clinical manifestations are presented as patterns: Ulcer (erosive), atrophic, reticular, papular and in plaques. The reticular lesion is the most common form of LPO which appears as a network of overlapping white streaks, followed by the ulcer (erosive) patterns, then atrophic and finally, plaques. The LPO appears frequently on both sides of the buccal mucosa, but it can also appear in the tongue, gums, or multiple sites. The malignant potential of OLP continues today as a controversial issue and the risk of malignant transformation of oral lichen planus suggests further research to determine the factors involved in this process. Objectives The objectives of this study were to conduct a clinical study of the lesions of OLP, their association with autoimmune diseases and investigate oxidative stress conditions. Material and Methods A study was conducted in 130 patients with oral lichen planus who met the inclusion criteria who were diagnosed clinically and histopathologically. We found that the most frequent clinical type was the reticular ones. Result There is a statistically significant association between the type of presentation and the symptoms reported by the patient. We found the presence of greater number of autoimmune diseases 0.07 % (10/130) in patients with OLP than in the control group 0.04 % (6/130). We found significant negative correlation between total antioxidant capacity of saliva and MDA levels in LPO Conclusion We found the presence of greater number of autoimmune diseases in patients with OLP than in the control group We found significant negative correlation between total antioxidant capacity of saliva and MDA levels in LPO
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Eﬁcacia del ácido hialurónico en terapia combinada frente a la monoterapia con corticoides tópicos en el liquen plano oral : impacto en el estrés oxidativo y parámetros salivales
(Universidad de Murcia, 2024-11-26) Rodríguez Gálvez, Rocío; López Jornet, Pía; Tvarijonaviciute, Asta; Escuela Internacional de Doctorado
Objetivos: En este estudio se evaluó la eficacia del ácido hialurónico en terapia combinada con corticoides tópicos en pacientes con liquen plano oral y analizó los marcadores salivales y estrés oxidativo. Métodos: Se diseñó un estudio controlado, aleatorizado y a doble ciego, de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y aprobado por la Comisión de Bioética de la Universidad de Murcia. Se han incluido un total de 95 pacientes con edades comprendidas entre 18 y 90 años. De ellos, 35 pacientes sanos (grupo control). Los 60 pacientes restantes, diagnosticados de liquen plano oral (grupo test). Los pacientes del grupo test se han dividido en 3 grupos (20 pacientes por grupo) de forma aleatoria y se les ha administrado el siguiente tratamiento según el grupo: - Grupo 1: Acetónido triamcinolona 0.2% + ácido hialurónico 0.1% en orabase (AT + AH) - Grupo 2: Acetónido triamcinolona 0.2% en orabase (AT) - Grupo 3: Ácido hialurónico 0.1% en orabase (AH) El tratamiento se ha administrado 2 veces al día en la zona afectada durante 1 mes en los tres grupos. Se completaron todos los test realizados, Thongrasom, Arduino, OHIP-14, HAD, recogida de muestra salival, cuestionario de satisfacción y tartrectomía. Resultados: La calidad de vida mejora significativamente independientemente del tratamiento que se utilice. Tanto el AH y AT o monoterapia mejoró todas las variables e índices de calidad de vida Thongransom y EVA respecto a la sintomatología y la calidad de vida OHIP 14. Se tomaron muestras salivales de los pacientes con LPO el primer día antes de hacer la tartrectomía y también después de realizar el tratamiento (1 mes). La tercera muestra salival fue al mes. Los resultados fueron que los marcadores SOD, GSH, CUPRAC, FRAP, TEAC, AOPP, ADA y alfa amilasa tuvieron un cambio significativo a lo largo del ensayo, independientemente del grupo de tratamiento. Se ha observado que los pacientes con liquen plano oral presentan los marcadores salivales CUPRAC, FRAP; TEAC, AOPP, alfa amilasa e IGA podrían tener capacidad discriminativa para diagnosticar el liquen plano oral frente a los pacientes sanos. Conclusiones: Los resultados del presente estudio sugieren que los tres protocolos de aplicación usados mejoran la calidad de vida de los pacientes y fueron efectivos para tratar el LPO sintomático. Además, CUPRAC, FRAP, TEAC, AOPP, alfa amilasa e IGA podrían ser de utilidad en el diagnóstico de LPO.
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Influencia de los factores orales en el estrés oxidativo salival
(Universidad de Murcia, 2023-11-22) Hynninen, Joonas Nikolai; Parra Pérez, Francisco; López Jornet, Pía; Escuela Internacional de Doctorado
Objetivos: El objetivo principal de este estudio fue analizar el estrés oxidativo salival en pacientes con enfermedad periodontal controlada y/o implantes dentales. Como objetivo secundario fue determinar las variables demográficas, clínicas, higiénicas y hábitos que supongan un factor de riesgo para la enfermedad periodontal. MÉTODOS: Para alcanzar el objetivo se tomaron muestras de saliva a un total de 160 pacientes que fueron divididos en 4 grupos: pacientes sin implantes y sin enfermedad periodontal y pacientes con implantes y sin enfermedad periodontal (controles), y pacientes sin implantes y con enfermedad periodontal controlada y pacientes con implantes y con enfermedad periodontal controlada (test). Se realizó un examen completo de la cavidad oral de cada paciente y un cuestionario personalizado para cada grupo que recogía la información referente a la calidad de vida (OHIP-14), hábitos higiénicos, historial médico e información de los implantes. Se midieron los siguientes parámetros en la saliva total no estimulada: capacidad de reducción férrica del plasma (FRAP), capacidad antioxidante equivalente a Trolox (TEAC), capacidad antioxidante cúprica reductora (CUPRAC), productos de oxidación avanzada de proteínas (AOPP) y proteínas totales (PT). RESULTADOS: Los valores medios obtenidos de los marcadores de estrés oxidativo en pacientes sin implantes y con implantes dentales fue FRAP (mmol/L) 0,590 ± 0,514 versus 0,588 ± 0,334 (p=0,974); TEAC(mmol/L) 0,320 ± 0,223 versus 0,315 ± 0,172 (p=0,879); CUPRAC (mmol/L) 0,286 ± 0,216 versus 0,288 ± 0,151(p=0,956); AOPP (µmol/L ) 456,04 ± 789,75 versus 430,65 ± 752,05 (p=0,838) y proteínas totales PT (mg/dL) 73,90 ± 50,83 versus 70,36 ± 56,93 (p=0,684). Los pacientes con tratamiento médico presentaban 2,81 con intervalo del confianza 95% [IC95%]:(1,39-5,69) veces más probabilidad de periodontitis que los pacientes sin tratamiento médico. Los fumadores presentaban 2,31 veces más probabilidad de periodontitis que los no fumadores. La satisfacción estética y masticatoria fue significativamente superior en los pacientes sanos con respecto a los pacientes con periodontitis controlada. A medida que aumentaba el índice de placa de O’Leary (peor higiene oral) aumenta la probabilidad de periodontitis. En cuanto a la frecuencia de cepillado, los que se cepillan 3 o más veces al día tienen 2.56 veces más probabilidad de no tener periodontitis comparado con los que se cepillan 2 veces al día. CONCLUSIONES: No se encontraron diferencias significativas en los niveles de estrés oxidativo salival entre pacientes con enfermedad periodontal controlada y/o implantes dentales comparado con pacientes sanos. En cambio la edad, el consumo de tabaco, mayor índice de placa y peor higiene son factores que aumentan de manera significativa la probabilidad de presentar enfermedad periodontal. Los pacientes con tratamiento médico tienen mayor probabilidad de presentar enfermedad periodontal. Encontramos una mejora significativa en la satisfacción estética y masticatoria en los pacientes con implantes dentales sin enfermedad periodontal.
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Nuevos marcadores de estrés oxidativo en perros. Aspectos técnicos y aplicaciones prácticas
(Universidad de Murcia, 2018-11-21) Peres Rubio, Camila; Hernández Ruiz, Josefa; Martínez Subiela, Silvia; Escuela Internacional de Doctorado
Los objetivos de esta tesis doctoral fueron aumentar el conocimiento sobre el posible uso y aplicaciones de los diferentes ensayos que pueden utilizarse para la determinación de la Capacidad Antioxidante Total (TAC) en perros y validar nuevos ensayos espectrofotométricos para evaluar TAC en suero de perros. Además, se buscó proporcionar una visión general de cómo el TAC medido por diferentes ensayos y otros marcadores de estrés oxidativo pueden comportarse en diferentes enfermedades del perro. Finalmente, se estudió la estabilidad de los diferentes ensayos de TAC, así como otros biomarcadores de estrés oxidativo en suero canino. En primer lugar, se investigaron los principales ensayos espectrofotométricos (capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox [TEAC], capacidad antioxidante de reducción del ión cúprico [CUPRAC] y capacidad de reducción férrica del plasma [FRAP]) utilizados para evaluar el TAC en muestras de fluidos de perros mediante la revisión de la base metodológica de cada uno, su aplicación práctica en la determinación de TAC, y también proporcionar información existente en humanos para un fin comparativo. Posteriormente, se validó en suero de perro un ensayo automatizado para medición de CUPRAC, basado en la reducción de Cu2+ en Cu1+ por la acción de los antioxidantes no enzimáticos presentes en la muestra, tres ensayos automatizados para mediciones de TEAC, basados en la capacidad de una muestra para reducir el radical ABTS, y un ensayo automatizado para la medición de FRAP, basado en la capacidad de los antioxidantes presentes en la muestra para reducir la forma férrica (Fe3+) a su forma ferrosa (Fe2+). Para estudiar la aplicación de los marcadores de estrés oxidativo en diferentes enfermedades del perro, se utilizaron perros enfermos infectados naturalmente por leishmaniosis canina, perros con enfermedad inflamatoria intestinal idiopática (IBD), perros con ehrlichiosis (CME) clínica y subclínica y perros con dermatitis atópica (AD) inducida y no inducida por alimentos. Por último, seis pools de suero de perros sanos se dividieron en varias alícuotas y se almacenaron a 4°C y 25°C durante un período de 6, 24 y 72 h, y a -20°C y -80°C durante un período de 7, 14, 30, 60, 180 y 360 días. Además, se evaluó el efecto del ciclo de congelación-descongelación repetido. Los métodos validados permitieron la determinación de TAC con buena precisión, sensibilidad y exactitud y detectaron bajas concentraciones de este analito en la inflamación y la infección. Cuando se evaluaron biomarcadores en diferentes enfermedades, el TEAC, CUPRAC y el tiol total disminuyeron en suero de perros con leishmaniosis. Además, CUPRAC y tiol aumentaron después del tratamiento contra esta enfermedad. Los perros con IBD tenían una disminución del TEAC, CUPRAC y tiol total, y un aumento de biomarcadores oxidantes en el suero como FOX, TBARS y ROS. Los perros con CME clínica mostraron disminución de CUPRAC, FRAP, TEAC y tiol total y aumento de ROS. En el caso de CME subclínica, todos los biomarcadores presentaron diferencia entre perros enfermos y sanos con excepción del TEAC. En el caso de perros con AD, estos presentaron concentraciones disminuidas de CUPRAC, TEAC y tiol total y aumentadas de FRAP y de FOX en comparación con perros sanos. En el estudio de estabilidad, la mayoría de analitos fueron estables hasta 24 horas a 4ºC. En caso de almacenamiento a largo plazo, el uso de -80ºC proporcionó una mejor estabilidad que a -20ºC. Además, todos los biomarcadores se vieron afectados por tres ciclos de congelación-descongelación. Los ensayos automatizados validados en esta Tesis para la determinación de TAC en muestras de suero canino son simples, rápidos y fáciles de realizar, y se pueden adaptar fácilmente a analizadores bioquímicos automatizados. Se recomienda utilizar un panel integrado por una combinación de ensayos de TAC para evaluar el estado antioxidante de una muestra, ya que los resultados de TAC pueden ser marcadamente diferentes dependiendo del ensayo realizado. Cuando se evaluaron biomarcadores del estrés oxidativo en diferentes enfermedades del perro, como la leishmaniosis, la IBD, la CME y la AD, se observó que cada enfermedad presentaba cambios particulares en los biomarcadores evaluados. Además, en el caso de la leishmaniosis canina algunos biomarcadores como CUPRAC y tiol fueron útiles para la monitorización del tratamiento. Como los biomarcadores oxidativos individuales pueden mostrar diferencias en la estabilidad, es importante tener en cuenta las condiciones de almacenamiento y el analito a medir cuando se van a usar muestras almacenadas. The objectives of this PhD thesis were to increase the knowledge about the possible use and applications of the different assays that can be used for Total Antioxidant Capacity (TAC) determination in dogs and to validate new different spectrophotometric assays to evaluate TAC in serum of dogs. In addition, we wanted to provide an overview of how TAC measured by different assays and others biomarkers of oxidative stress can behave in different diseases in dogs. Finally, the stability of the different TAC assays as well as other oxidative stress biomarkers in canine serum was studied. First, the main spectrophotometric assays (Trolox equivalent antioxidant capacity [TEAC], cupric reducing antioxidant capacity [CUPRAC] and ferric reducing ability of plasma [FRAP]) used in dogs to evaluate the TAC in fluid samples were investigated by reviewing the basis of each one, their practical application in the determination of TAC in dogs, and also providing selected information about reports in humans for comparative purposes. Subsequently, an automated assay for CUPRAC measurement, based on the reduction of Cu2+ into Cu1+ by the action of the non-enzymatic antioxidants presented in the sample, three automated assays for TEAC measurements, based on the ability of a sample to reduce ABTS•+, and one automated assay for FRAP measurement, based on the ability of the antioxidants present in the sample to reduce ferric (Fe3+) to its ferrous (Fe2+) form, were validated for use in serum of dogs. The behaviour of the different biomarkers of oxidative stress in different canine diseases was assessed by using sick dogs naturally infected by canine leishmaniosis, dogs with inflammatory bowel disease (IBD), dogs with clinical and subclinical ehrlichiosis (CME), and dogs with non-food and food-induced atopic dermatitis (AD) were used. Last, six serum pools from healthy dogs were divided in various aliquots and stored at 4º C and 25 ºC for a period of 6, 24 and 72 h, and at -20 ºC and -80 ºC for a period of 7, 14, 30, 60, 180, and 360 days. In addition, the effect of repeated freeze-thaw cycle was evaluated. The methods validated allowed the TAC determination in a precise, accurate and sensitive way and detected decreased concentrations of this analyte in inflammation and infection disease. When individual biomarkers were evaluated in different diseases, serum TEAC, CUPRAC, and total thiol were decreased in dogs with leishmaniosis. In addition, CUPRAC, and thiol increased after treatment against this disease. Dogs with IBD had decreased serum TEAC, CUPRAC, and total thiol, and increased oxidant biomarkers in serum such as FOX, TBARS and ROS. Dogs with clinical CME showed decreased CUPRAC, FRAP, TEAC and total thiol and increased ROS. In the case of subclinical CME all the biomarkers were also different from the healthy dogs with exception of the TEAC. Oxidative stress also may play a role in the pathogenesis of AD in dogs, which had decreased concentrations of serum CUPRAC, TEAC, and total thiol and increased FRAP, and increased FOX when compared with healthy dogs. In relation to the stability study, most of the analytes were stable for up 24 h at 4 ºC. In case of long-term storage, the use of -80 ºC provides a better stability than at -20 ºC. In addition, all biomarkers are affected by three freeze-thaw cycles. The automated assays validated in this Thesis for TAC determination in canine serum samples are simple, fast, and easy to perform, and can be easily adapted to automated biochemical analysers. A panel integrated by a combination of TAC assays should be used for evaluation of antioxidant status of a sample, because the results of TAC could be markedly different depending on the assay performed. When oxidative stress biomarkers were evaluated in different diseases of the dog such as leishmaniosis, IBD, CME and AD, it was observed that each disease had particular changes in the biomarkers evaluated. In addition, in the case of canine leishmaniosis some biomarkers such as CUPRAC and thiol were useful for treatment monitoring. As individual oxidative biomarkers can show differences in stability, it is important to consider the storage conditions of each analyte when stored samples are used.
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Tratamientos poscosecha para el control de los daños por frío en frutos climatéricos y no climatéricos
(2016-06-06) Romojaro Casado, María del Carmen; Martínez Madrid, Mª Concepción; Pretel Pretel, Mª Teresa; Facultad de Química
Dado que en los frutos climatéricos la mayoría de los procesos relacionados con la maduración están regulados por el etileno, esta hormona podría participar en el desarrollo de los daños por frío (DF). En el caso de los frutos no climatéricos, aunque el etileno no interviene en el desencadenamiento y desarrollo de la maduración, podría también tener un efecto inductor de los DF en las especies sensibles, ya que también el deterioro se inicia por la degradación de las membranas celulares. En la presente Memoria se realizó un estudio de conservación de dos frutos sensibles a DF, uno climatérico como la chirimoya y otro no climatérico como el calabacín, a temperatura que no causa DF (10ºC para calabacín y 12ºC para chirimoya) y temperatura que causa DF (1ºC para calabacín y 4ºC para chirimoya). Tras un periodo de mantenimiento a temperatura ambiente se analizaron los síntomas de DF, las modificaciones de compuestos característicos de la calidad, del estrés oxidativo de las membranas celulares, y los mecanismos antioxidantes de defensa enzimáticos y no enzimáticos. Los resultados mostraron que la conservación a temperaturas de DF retardó la pérdida de peso en ambos frutos, en relación a la temperatura de no daño. Los primeros síntomas visibles de DF en calabacines conservados a 1ºC se detectaron a partir de los 12 días. El reacondicionamiento a 20ºC agravó la deshidratación de los frutos y los DF. Los tratamientos con 1-MCP y etileno, previos a la conservación a 1ºC de frutos de calabacín, parecen no tener efecto o incluso agravar los síntomas de daños causados por el frío, más que proteger frente a este factor de estrés. Por otro lado, a pesar de no presentar síntomas visibles de deterioro, los DF en chirimoya se manifestaron en una maduración anómala, considerando la evolución de los sólidos solubles, acidez, pH y color durante su almacenamiento. En frutos sensibles a DF, las temperaturas de refrigeración superiores a la temperatura de congelación provocan la pérdida de estructura de la bicapa lipídica y finalmente la lisis celular. En este trabajo se estimó el estado oxidativo y la integridad de las membranas celulares mediante el porcentaje de salida de electrolitos y el contenido en peróxidos lipídicos. En calabacín, el almacenamiento a 1ºC provocó un aumento significativo de la salida de electrolitos y de la peroxidación lipídica. La respuesta ante el estrés provocado por las bajas temperaturas en los frutos de calabacín fue siempre mayor en piel que en pulpa, ya que es en la piel donde se desarrolla principalmente la fisiopatía de los daños por frío. Las chirimoyas conservadas a 12ºC presentaron mayor salida de electrolitos y peroxidación lipídica que cuando se almacenaron a 4ºC, confirmando que a 12ºC ocurre la desestructuración de las membranas, típica del proceso de maduración, que no llega a ocurrir a 4ºC. Hoy día se considera que en la maduración y senescencia de los frutos están implicados procesos oxidativos. Para evitar estos daños, la célula ha desarrollado en las plantas captadores de oxígeno o antioxidantes, vías metabólicas de detoxificación enzimática y mecanismos de reparación. Paralelamente a la producción de especies reactivas de oxígeno, las plantas se protegen de los efectos del estrés mediante un sistema antioxidante complejo que incluye la síntesis de metabolitos antioxidantes. En este trabajo se encontró que el contenido en compuestos fenólicos se incrementó durante la primera semana de conservación en la piel de ambos frutos, especialmente en calabacines conservados a temperatura de daño (1ºC) y en chirimoya conservada a temperatura de no daño (12ºC). En el primer caso coincidiendo con la fase de alarma frente al estrés, y en el segundo coincidiendo con el proceso normal de maduración de la chirimoya. El contenido de fenoles en la pulpa de ambos frutos fue menos sensible que la piel, a los cambios de temperatura y los tratamientos. No se apreció ningún efecto significativo de los tratamientos sobre los niveles de ácido ascórbico en la piel de calabacín ni chirimoya. Las bajas temperaturas afectaron de forma diferente a la capacidad antioxidante de la piel y la pulpa de ambos frutos. Mientras que en piel la conservación a temperatura de DF disminuyó la capacidad antioxidante, en pulpa se incrementó este parámetro. Los tratamientos con etileno y su antagonista no tuvieron un efecto claro sobre la capacidad antioxidante, por lo que no parece que el etileno esté implicado en los mecanismos no enzimáticos de detoxificación de estos frutos. Dentro de los sistemas de detoxificación enzimáticos, el aumento de las actividades peroxidasa y catalasa conjuntamente, como respuesta a un estrés oxidativo conlleva una disminución del peróxido de hidrógeno producido y, por tanto, un incremento de la tolerancia hacia los daños por frío.. En calabacín, la disminución de la actividad catalasa, el aumento de salida de electrolitos y el aumento de los síntomas visibles de daños por frío, apuntan a un alto grado de deterioro de los tejidos y a la desorganización estructural, como consecuencia del daño, y a la incapacidad de los mismos para responder de manera defensiva al estrés oxidativo derivado del exceso de radicales y especies reactivas de oxígeno generados. Por lo tanto el sistema es sobrepasado y ocurre daño celular y subcelular. Según los resultados obtenidos en la presente memoria, se puede pensar en la posible contribución de la catalasa para rebajar el extres oxidativo en pulpa de chirimoya. En piel de calabacín se observó una activación de la actividad peroxidasa en los frutos como consecuencia del estrés oxidativo provocado por las bajas temperaturas. Los tratamientos con 1-MCP o etileno redujeron ligeramente la actividad peroxidasa en este tejido. Finalmente, a pesar de las diferencias entre los valores de actividad en la piel o en la pulpa de chirimoyas sometidas a los diferentes tratamientos, en la mayoría de los casos, las diferencias no fueron significativas. Es por ello difícil pensar que esta enzima antioxidante juegue un papel importante en los procesos de detoxificación y en el mantenimiento del estado oxidativo celular de chirimoya. ABSTRACT Since most processes related to ripening are regulated by ethylene in climacteric fruits, this hormone could be implied in the development of chilling injury (CI). Regarding non-climacteric fruits, although ethylene does not take part in the triggering and development of ripening, it could also have a CI inducing effect in sensitive species, because the deterioration starts with the degradation of cell membranes. In this Report a storage study of two fruits sensitive to CI, one climacteric like cherimoya and other non-climacteric like courgette, at a temperature not causing CI (10 ºC for courgette and 12 ºC for cherimoya) and at a temperature causing CI (1 ºC for courgette and 4 ºC for cherimoya) has been carried out. After a period of storage at room temperature, the symptoms of CI, the changes in those compounds characteristics of quality, the oxidative stress of cell membranes and the enzymatic and non enzymatic antioxidant defence mechanisms were analysed. The results showed that storage at CI temperatures delayed the weight loss in both fruits, in comparison to the non-CI temperature. The first visible symptoms of CI in courgettes stored at 1 ºC were found after 12 days. The reconditioning at 20 ºC worsened the dehydration of fruits and the CI. The treatments with 1-MCP and ethylene before storage at 1 ºC of courgette fruits seem to have no influence or to worsen the symptoms of CI instead of protecting against this stress factor. On the other side, despite they do not present visible symptoms of deterioration, CI in cherimoya fruits were evident in an anomalous ripening when considering the evolution of soluble solids, acidity, pH and colour. In fruits sensitive to CI, the refrigeration temperatures over the freezing point cause an increase of the non-specific permeability to ions and renders the enzymes linked to the membrane inactive; the result is the loss of the structure of the lipid bilayer and, finally, the cell lysis. In this work, the oxidative state and the integrity of cell membranes were assessed by the percentage of electrolyte leakage and the content of lipid peroxides. In courgette, the storage at 1 ºC caused a significant increase of the electrolyte leakage and the lipid peroxidation, both in control fruits and in fruits treated with 1-MCP. The treatment with ethylene stressed the degradation of the membrane structures caused by cold. The response against the stress caused by low temperatures in courgette fruits was always higher in the skin than in the pulp, because the physiopathy of chilling injury develops mainly in the skin. The cherimoyas stored at 12 ºC showed higher electrolyte leakage and lipid peroxidation than those stored at 4 ºC, so it can be stated that at 12 ºC the membrane disintegration typical of the ripening process occurs, a fact not occurring at 4 ºC. Today, it is considered that, during ripening and senescence of the fruits, oxidative processes are implied in order to avoid these damages. The plant cell has developed oxygen scavengers or antioxidants, metabolic paths of enzymatic detoxification and repair mechanisms. In parallel with the production of oxygen reactive species, plants protect themselves against the effects of stress by a complex antioxidant system that includes the synthesis of antioxidant metabolites. In this work, it was observed that the content of phenolic compounds increased during the first week of storage in the skin of both fruits, specially in courgettes stored at CI temperature (1 ºC) and in cherimoya stored at non-CI temperature (12 ºC). In the first case, it occurs at the same moment as the stage of alarm against stress and, in the second one, during the normal process of ripening of cherimoya. The content of phenols in the pulp of both fruits was less sensitive to temperature changes and treatments than the skin. There was not a significant effect of treatments on the levels of ascorbic acid in the skin of courgette or cherimoya. Low temperatures affected in different ways the antioxidant capacity of skin and pulp in both fruits. While in skin the storage at CI temperature decreased the antioxidant capacity, this parameter increased in pulp. The treatment with ethylene and its antagonist did not clearly affect the antioxidant capacity, so it seems that ethylene is not involved in non-enzymatic detoxification mechanisms of these fruits. Considering the enzymatic detoxification systems, the increase of peroxidase and catalase activities as a joint response to oxidative stress implies a decrease of the hydrogen peroxide produced and, therefore, an increase of the tolerance towards chilling injury. While the catalase presents a high reaction speed and a low affinity for hydrogen peroxide, the peroxidase has a great affinity for hydrogen peroxide and makes small H2O2 uptakes in specific locations. Its antioxidant capacity depends on the stress severity and on the species and their development state. In courgette, the decrease of the activity of catalase, the increase of the electrolyte leakage and the increase of the visible symptoms of chilling injury point at a high degree of deterioration of tissues and structure disintegration, as a consequence of the damage and their inability to defensively respond to oxidative stress caused by the excess of radicals and oxygen reactive species, so the cell and subcell damage occurs. According to the results obtained in this report, it is difficult to believe that catalase plays a significant role in detoxification processes and in the maintenance of the cell oxidative state of cherimoya skin. In courgette skin there was an activation of the peroxidase activity in fruits as a consequence of the oxidative stress caused by low temperatures. The treatments with 1-MCP or ethylene slightly reduced the peroxidase activity in this tissue. Finally, despite the differences between the values of activity in skin or pulp of cherimoya that underwent the different treatments, in most cases, the differences were not significant or values were very low. Then, it is difficult to believe that this antioxidant enzyme plays a significant role in detoxification processes and in the maintenance of the cell oxidative state of cherimoya.
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Valoración de marcadores inflamatorios y estrés oxidativo en un grupo de pacientes con enfermedad periimplantaria
(2016-01-14) Lucas Azorín, Javier; Camacho Alonso, Fabio; Sánchez Siles, Mariano; Carbonell Meseguer, Luis Fernando; Departamento de Dermatología, Estomatología, Radiología y Medicina Física
El propósito de este estudio fue saber si la enfermedad peri-implantaria causa un aumento de marcadores de estrés oxidativo en la concentración de saliva total. Para dicho estudio se usó una muestra de 70 pacientes (28 hombres y 42 mujeres) divididos en tres grupos, 30 pacientes con implantes dentales y peri-implantitis, 30 pacientes con implantes sin peri-implantitis y 10 pacientes control sin implantes y un estado de salud general bueno. Se midieron las siguientes variables periodontales /peri-implantológicas: índice de sangrado, índice gingival, nivel de inserción clínica, profundidad de sondaje, presencia de bolsas mayores de 4-6 mm, dolor a la percusión, supuración, hiperplasia gingival y granuloma, pérdida de hueso cresta (tanto mesial como distal) y evaluación ósea mediante radiografías periapicales. Se tomaron muestras de saliva para la medición de nuestros marcadores de estrés oxidativo: concentración de malondialdehido y de mieloperoxidasa. La concentración de mieloperoxidasa y malondialdehido fue ligeramente superior en el grupo de pacientes con enfermedad peri-implantaria que en el grupo de pacientes con implantes sin enfermedad y que en el grupo control pero no se encontraron diferencias significativas. La conclusión es que la concentración de marcadores de estrés oxidativo, medidos en saliva, en pacientes con peri-implantitis y sin peri-implantitis no es más alta que la encontrada en pacientes sanos. Javier Lucas Azorín 2015 ABSTRACT: The purpose of this study was to know if peri-implantitis causes an increase in the total salivary concentration of oxidative stress markers. For this study we had a sample of 70 patients (28 men and 42 women) divided in three groups, 30 patients with dental implants and peri-implantitis, 30 patients with dental implants without peri-implantitis and 10 control group patients without any dental implants and perfect state of health. We measured different periodontal and peri-implant variables: bleeding index, gingival index, clinical attachment level, probing depth, presence of pockets larger than 4 and 6 mm, pain to percussion, suppuration, gingival hyperplasia or granuloma, crestal bone loss (both mesially and distally) and bone evaluated through periapical radiography. We took saliva samples for the measurement of our stress oxidative markers: malondialdeyde and myeloperoxidase concentrations. Total salivary Myelperoxidase and malondialdeyde concentration were slightly higher in the group of patients with dental implants and peri-implantitis than in the group with dental implants without peri-implantitis and with the control group but we did not find significant differences. The conclusion was that the stress oxidative markers measured in saliva, in patients with peri-implantitis or without peri-implantitis are not higher than those found in healthy patients.

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