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    Análisis de la expresión génica de la resistencia a plum pox virus en albaricoquero (prunus armeniaca L.)
    (2016-11-08) Olivares Belchí, Pedro Manuel; Martínez Gómez, Pedro; Rubio Angulo, Manuel; Escuela Internacional de Doctorado
    El albaricoquero (Prunus armeniaca L.) es una especie diploide con un genoma de 2n=2x=16 cromosomas. Pertenece a la familia Rosaceae siendo una de las especies del género Prunus más importantes desde el punto de vista agrícola ya que representa el tercer frutal de hueso en importancia económica a nivel mundial después de melocotonero y ciruelo. Esta tesis doctoral describe la respuesta diferencial a nivel genómico, transcriptómico y hormonal frente a PPV en dos variedades de albaricoquero, ‘Rojo Pasión’ (resistente) y ‘Z506-7’ (susceptible). A partir de los resultados del análisis de variaciones de secuencia de microsatélites (Simple sequence repeat, SSRs) y variaciones de nucleótidos (SNPs) en el genoma de albaricoquero, basándonos en la secuenciación de alto rendimiento del RNA (RNA-Seq) y combinando la espectrometría de masas para el genotipado de SNPs, podemos decir que se trata de un enfoque que proporciona una alta flexibilidad, reproducibilidad y precisión en los ensayos, suponiendo una herramienta sólida para detectar diversidad de nucleótidos en regiones codificantes del genoma del Prunus. Los resultados obtenidos muestran sin lugar a dudas la gran influencia del LG 1 en la resistencia al PPV en albaricoquero. Estos datos nos ayudan a enfocar estudios dirigidos hacia zonas más concretas del genoma en la búsqueda de QTLs que controlen un mayor porcentaje de la variación del carácter, saturando otras zonas de interés fuera del PPVres y diseñando marcadores específicos que nos aporten información de la expresión fenotípica de determinados caracteres en cada uno de los descendientes de una población. Por otro lado, desde el punto de vista metodológico, el RNA-Seq se ha mostrado como una herramienta muy poderosa en el análisis de la interacción PPV/albaricoquero aunque no parece ser la herramienta definitiva para resolver los problemas de expresión base ni los determinantes genéticos. El RNA-Seq se presenta como una herramienta complementaria a los estudios genómicos con menor cantidad de datos. Las diferencias transcriptómicas a nivel de expresión de genes confirmaron que la susceptibilidad a PPV en albaricoquero es un proceso complejo basado en la batalla continua entre el virus (PPV) y la planta (Prunus armeniaca) a nivel de genes de resistencia del patógenos y a nivel de silenciamiento génico similar a la respuesta observada en melocotonero en trabajos anteriores. La resistencia a PPV en albaricoquero es también un proceso complejo que también se basa en una batalla continua entre el virus (PPV) y la planta (Prunus) donde los genes MATH (control a larga distancia de los movimientos del virus) están involucrados junto a otros genes. La respuesta de resistencia que se observa en el albaricoquero es diferente de la respuesta que se observa en ciruelos hipersensibles resistentes. Por tanto parece que si bien la susceptibilidad es un proceso similar entre especies la resistencia depende de cada especie. Finalmente, la respuesta hormonal en diferentes variedades de albaricoquero resistentes y susceptibles a PPV y en melocotonero GF305 control e inoculadas pusieron de manifiesto la importante implicación del SA y la citoquinina trans-Zeatina en la infección del virus en Prunus. Es de destacar que tras la inoculación de la variedad de albaricoque ‘Rojo Pasión’ con PPV se produce un descenso de los niveles de ABA que puede ser el responsable de favorecer la señalización de la ruta del SA. El descenso del ABA favorece favorece las condiciones oxidativas dentro de la célula lo que a su vez induce la forma monomérica del NPR1, que es capaz de ser traslocada al núcleo e indicar la señalización de las respuestas mediadas por el SA.ABSTRACT: Apricot (Prunus armeniaca L.) is a diploid specie with a genome of 2n = 2x = 16 chromosomes included inside the Rosaceae family and is one of the most important species of Prunus from an agricultural point of view. Apricot production around the globe places it as the third stone fruit in terms of worldwide economic importance after peach and plum. The objective of this thesis has been to carry out a study about Plum pox virus (PPV) resistance analysis at genomic, transcripromitc and phytohomonal level in the apricot genotypes ‘Rojo Pasión’ (resistant) and ‘Z506-7’ (susceptible). Genomic approaches are focused on improving the development and analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) via an efficient and flexible method combining high throughput sequencing (RNA-Seq) and mass spectrometry. We designed 136 SNPs from the RNA-Seq genotypes ‘Rojo Pasión’ and ‘Z506-7’ (‘Orange Red’ × ‘Currot’). We can therefore consider RNA sequencing as an efficient method for generating high quality molecular markers in apricot. These results provide accurate values for nucleotide diversity in coding sequences in apricot. Thus, the combination a highly efficient RNA-Seq approach and the SNPlex™ high-throughput genotyping technology provide a powerful and flexible tool for apricot genetic analysis. SSR and SNP analysis show without any doubt the great influence of LG 1 on PPV resistance in apricot in the PPVres region. This information allows us to focus in on more specific regions of the genome in the search for major QTLs that control a greater percentage of the variation of the trait. RNA-Seq has proven to be a very powerful tool in the analysis of the Plum pox virus (PPV, sharka disease)/Prunus interaction. This technique is an important complementary tool to other means of studying genomics. In this work an analysis of gene expression of resistance/susceptibility to PPV in apricot is performed. RNA-Seq has been applied to analyse the gene expression changes induced by PPV infection in leaves from two full-sib apricot genotypes, ‘Rojo Pasión’ and ‘Z506-7’, resistant and susceptible to PPV, respectively. Transcriptomic analyses revealed the existence of more than 2,000 genes related to the pathogen response and resistance to PPV in apricot. These results showed that the response to infection by the virus in the susceptible genotype is associated with an induction of genes involved in pathogen resistance such as the allene oxide synthase, S-adenosylmethionine synthetase 2 and the major MLP-like protein 423. Over-expression of the Dicer protein 2a may indicate the suppression of a gene silencing mechanism of the plant by PPV HCPro and P1 PPV proteins. On the other hand, there were 164 genes involved in resistance mechanisms that have been identified in apricot, 49 of which are located in the PPVres region (scaffold 1 positions from 8,050,804 to 8,244,925), which is responsible for PPV resistance in apricot. Among these genes in apricot there are several MATH domain-containing genes, although other genes inside (Pleiotropic drug resistance 9 gene) or outside (CAP, Cysteine-rich secretory proteins, Antigen 5 and Pathogenesis-related 1 protein; and LEA, Late embryogenesis abundant protein) PPVres region could also be involved in the resistance. Finally, the hormonal response in different apricot and peach resistant and susceptible genotypes to PPV GF305 control and inoculated highlighted the important implication of SA and cytokinin trans-Zeatin virus infection in Prunus. It is noteworthy that after inoculation of apricot variety 'Red Passion' with PPV decreased ABA levels may be responsible for promoting signalling pathway SA occurs. The decrease of ABA promotes oxidative conditions favours within the cell the monomeric form of NPR1, which is capable to induce changes signalling SA mediated responses.
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    Edición de genes de tomate que codifican potenciales factores provirales para el virus del mosaico del pepino dulce
    (Universidad de Murcia, 2020-12-03) Rodríguez Sepúlveda, Pascual; Aranda Regules, Miguel Ángel; Donaire Segarra, Livia; Hernando Saiz, Yolanda; Escuela Internacional de Doctorado
    El virus del mosaico del pepino dulce (PepMV; especie Pepino mosaic virus, género Potexvirus; familia Alphaflexiviridae) es un virus de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva que causa una de las principales enfermedades que afectan a los cultivos de tomate de todo el mundo, provocando importantes pérdidas económicas. En la actualidad, no se dispone de variedades de tomate comerciales resistentes a PepMV y las fuentes de resistencia descritas son poco apropiadas para su uso en programas de mejora. Así, la identificación de dianas genéticas para conseguir resistencia a este virus tiene un gran interés aplicado. Por otra parte, el sistema experimental PepMV/tomate está adquiriendo una importancia creciente, por lo que profundizar en el conocimiento de los aspectos moleculares de la interacción PepMV/tomate tiene, en sí mismo, un importante interés de tipo fundamental. En el primer capítulo de esta tesis, se describe la identificación de 21 proteínas de tomate que interaccionan con alguna de las proteínas de PepMV mediante un escrutinio en levadura, utilizando una genoteca de ADNc normalizado de plantas de tomate sanas e infectadas. El silenciamiento génico inducido por virus (virus induced gene silencing, VIGS) de los genes que codificaban estas proteínas no resultó en signos fenotípicos diferentes al de las plantas de genotipo silvestre (wild type, WT) en la mayoría de los casos. Las plantas silenciadas en los genes que codifican las proteínas RdRp-IP5, TGB1-IP12 y TGB2-IP18 mostraron una disminución de la acumulación de PepMV además de conservar un fenotipo similar al de las plantas WT. TGB2-IP12 estaba anotada funcionalmente como una serina/treonina quinasa, pero las otras dos proteínas no estaban anotadas. El análisis bioinformático de RdRp-IP5 sugiere que pertenece a la superfamilia de proteínas NTF2 con un posible papel en la respuesta a estreses bióticos, mientras que para TGB2-IP18 no encontró una posible función, aunque tiene un gen ortólogo en Arabidopsis thaliana anotado como parte del complejo citocromo b6f. La localización subcelular de estas proteínas fusionadas a proteínas fluorescentes mediante microscopía de barrido láser confocal en células sanas e infectadas de Nicotiana benthamiana resultó en la colocalización de RdRp-IP5 y TGB1-IP12 en estructuras similares a los complejos de replicación viral (viral replication complexes, VRCs) descritos previamente. Sin embargo, la proteína TGB2-IP18, mantuvo su localización en los cloroplastos de las células infectadas. Por último, se generaron mutantes de tomate knockout homocigóticos para los genes que codifican RdRp-IP5 y TGB1-IP12 respectivamente, y un mutante heterocigótico con un solo alelo editado para el gen que codifica TGB2-IP18 utilizando el sistema CRISPR/Cas9. En las plantas mutantes rdrp-ip5 y tgb2-ip18 no se alteró la acumulación de PepMV. Sin embargo, las plantas mutantes tgb1-ip12 infectadas mostraron un aumento de la acumulación del virus, lo que sugiriere que TGB1-IP12 pueda tener un papel durante la infección de PepMV en tomate. En el trabajo que se describe en el segundo capítulo, se obtuvieron 7 mutantes de tomate cv. Micro-Tom para los genes que codifican las proteínas interactoras de la TGB2 (TGB2-IP14-21) para analizar si alguna de estas proteínas tiene un papel durante la infección por PepMV. En los mutantes tgb2-ip19 y tgb2-ip21 infectados aumentó la acumulación del virus significativamente. TGB2-IP19 es una metiltransferasa tipo 11 dependiente de S-adenosilmetionina, mientras que TGB2-IP21 está anotada como proteína de función desconocida. El estudio in silico llevado a cabo sugiere la localización de TGB2-IP19 en el núcleo y el citoplasma y una posible implicación en la respuesta a estreses bióticos, mientras que para TGB2-IP21 se predijo una localización anclada a las membranas del retículo endoplásmico (RE) o mitocondriales y que puede que esté relacionada con algún proceso implicado en la respuesta a estrés biótico, aunque no se pudo predecir una función. En el trabajo descrito en el tercer capítulo, se expresó la TGB2 de PepMV fusionada a proteínas fluorescentes en N. benthamiana. Un análisis mediante microscopía de barrido láser confocal mostró una señal fluorescente que colocalizaba con un marcador específico de RE. La expresión de TGB2 fusionada a mRFP en plantas de N. benthamiana infectadas con PepGFPm2 resultó en la relocalización de la señal fluorescente de TGB2 al interior de los VRCs. Además, la coexpresión de TGB2 con su interactor TGB2-IP19 mostró una colocalización de la señal fluorescente en el núcleo y el citoplasma en plantas no infectadas, y una relocalización de la señal fluorescente de ambas proteínas a los VRCs en plantas infectadas con PepGFPm2
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    Estudios in vivo e in vitro sobre algunos aspectos de la respueta inmunitaria innata frente al virus PRRS= In vivo and in vitro studies on some aspects of the innate immune response against PRRSV
    (2014-09-08) García Nicolás, Obdulio; Pallarés Martínez, Francisco José; Ramis Vidal, Manuel Guillermo; Quereda Torres, Juan José; Facultad de Veterinaria
    Objetivos. Primero: determinación de la susceptibilidad de macrófagos derivados de monocitos activados por citocinas a ser infectados por diferentes cepas del genotipo 1 y 2 de PRRSV. Segundo: evaluación de la modulación de la respuesta inmune por la cepa 2982 de PRRSV-1 en pulmón, tonsila y nódulos linfáticos de credos infectados. Tercero: caracterización de la respuesta inmune inducida por diferentes cepas de PRRSV-1 que varían en virulencia en distintos compartimentos de nódulo linfático mediastínico (Med-LN) de cerdos infectados. Metodología. En el experimento in vitro se seleccionaron monocitos de PBMC de cerdos SPF y se incubaron durante 72 h para permitir la diferenciación en macrófagos. Entonces esas células se estimularon con citocinas durante 24 h: IFN-γ (M1), IL-4 (M2), IFN-β o no estimulados. Después mediante citometría de flujo se evaluó el fenotipo de los diferentes macrófagos (CD16, MHC I, MHC II, CD86, CD16 and CD14). La infección de macrófagos por PRRSV se cuantificó por medición de la nucleocápside mediante citometría de flujo. En el sobrenadante se midió por ELISA IFN-α, TNF-α, and IL-10. Para el primer estudio in vivo 28 cerdos SPF se infectaron intramuscularmente con la cepa 2982 de PRRSV-1 y se eutanasiaron humanitariamente a 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 dpi. Se dejaron 4 animales como grupo control negativo, que se eutanasiaron a los 24 dpi. Los niveles de transcripción de citocinas proinflamatorias (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 y TNF-α) e inmunododuladoras (IL-10 y TGF-β) se midieron mediante RT-qPCR. Para el segundo experimento in vivo 76 lechones SPF fueron aleatoriamente agrupados en 3 grupos de 20 animales para la infección, y los restantes 16 se dejaron como control. Se utilizaron tres cepas de PRRSV-1 con distinta virulencia: LV como prototipo, 215-06 del subtipo 3, y la SU1-bel del subtipo 3. Los animales se eutanasiaron humanitariamente a los 3, 7 y 35 dpi. El folículo y área inter-folicular de Med-LN se tomaron separadamente mediante captura por microdisección láser. Los niveles de transcripción de citocinas (IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-23p19, IL-10 and TGF-β) y de SOCS1 se evaluaron por RT-qPCR. Las poblaciones celulares de Med-LN se evaluaron por inmunohistoquímica. Resultados. Los macrófagos estimulados por citocinas desarrollan diferente fenotipo comparado con macrófagos no polarizados. Los cultivos celulares de macrófagos polarizados por citocinas pueden muestran diferencias importantes entre cepas de PRRSV. Mientras que los macrófagos no polarizados y M2 son sensibles a todas las cepas de PRRSV, el tratamiento de macrófagos con IFNs induce un claro estado antivírico en dichas células con una menor infección y replicación de PRRSV. Sólo los M1 infectados con LVP23 produjeron cierta cantidad de IFN-α. Este tipo de macrófagos representan un flexible modelo in vitro alternativo al empleo de líneas celulares derivadas de mono o a macrófagos alveolares porcinos. El primer estudio in vivo mostró que la cepa 2982 del PRRSV-1 es capaz de evadir el establecimiento de respuesta inmune innata efectiva, permitiendo una expresión génica de IFN- α 1 y TNF-α disminuida, y una respuesta inmune adquirida débil y retardada, por una expresión ineficiente de IL-12 e IFN-γ. El segundo experimento in vivo demostró que PRRSV permanece alojado en Med-LN al menos hasta 35 dpi, y la cepa SU1-bel es la que posee una mayor capacidad de replicación. Las cepas de PRRSV-1 evitaron el establecimiento correcto de la respuesta inmune en cerdos infectados mediante la depleción de células linfáticas y disminución de la expresión de IFN- α y TNF-α en los compartimentos de Med-LN. Finalmente, los resultados sugieren que la inducción de IL-10 por PRRSV con el propósito de retrasar la respuesta inmune del hospedador no es una estrategia común a todos los aislados de PRRSV-1. Objectives. First: determination of the cytokine primed monocyte-derived macrophages susceptibility to be infected by different PRRSV-1 and 2 strains. Second: evaluation of the swine immune response modulation by PRRSV-1 2982 strain in lung, tonsil, tracheobronchial and retropharyngeal lymph nodes of infected pigs. Third: characterization of the immune response induced by several PRRSV-1 strains varying in virulence in distinct compartments of mediastinal lymph node (Med-LN) (follicle and inter-follicular areas) of infected pigs. Methodology. For the in vitro experiment, monocytes were isolated from PBMC of SPF pigs and incubated during 72 h to lead the macrophage differentiation. Then, these cells were stimulated during 24 h with cytokines: IFN-γ (M1), IL-4 (M2), IFN-β or no stimulated. After that the phenotype of the different macrophages were evaluated by flow cytometry (CD16, MHC I, MHC II, CD86, CD16 and CD14). Several PRRSV-1 and PRRSV-2 strains were used to infect macrophages. PRRSV infection of macrophages was evaluated by nucleocapsid protein acquisition by flow cytometry. In the supernatant IFN-α, TNF-α, and IL-10 were determined by ELISA. For the first in vivo experiment 28 SPF pigs were infected intramuscularly with PRRSV-1 2982 isolate and were humanely euthanized at 3, 7, 10, 14, 17, 21 and 24 dpi. Four pigs were kept as non-infected control group, being humanely euthanized at 24 dpi. The proinflammatory (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 and TNF-α) and immunomodulatory (IL-10 and TGF-β) cytokines transcript levels were evaluated by means of RT-qPCR. For the second in vivo experiment, 76 SPF piglets were ramdonly allocated in groups of 20 animals for the viral infection and the 16 remaining animals as control group. Three PRRSV-1 isolates varying in virulence were selected in this study: LV as prototype, 215-06 from subtype 1, and SU1-bel from subtype 3. Animals were humanely euthanized at 3, 7 and 35 dpi. Med-LN follicle and inter-follicular areas were separately selected by Laser Microdissection Capture. Cytokines (IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-23p19, IL-10 and TGF-β) and SOCS1 transcript levels were evaluated by means of RT-qPCR. The lymph node cell populations were evaluated by immunohistochemistry. Results. The in vitro experiment showed that stimulated macrophages developed different phenotype compared with non polarized macrophages. Cytokine-primed macrophages cultures can reveal important PRRSV strain differences. Whereas undifferentiated macrophages and M2 are sensitive to all PRRSV strains, IFN-γ and IFN-β treatment of macrophages induced a clear antiviral state in macrophages with reductions in virus infection and replication. Only IFN-α production was detected in the supernatant of M1 infected with LVP23 PRRSV-1 strain. These macrophages represent a flexible in vitro model alternative against monkey cell lines and porcine alveolar macrophages. The first in vivo experiment showed that PRRSV-1 strain 2982 is able to evade the onset of an effective innate immune response, leading to an impaired expression of IFN-α 1 and TNF-α gene expression, and a weak and delayed acquired immune response through an inefficient IL-12 and IFN-γ expression. This experiment showed that PRRSV remains allocated in follicle of lymph node during at least 35 dpi, and SU1-bel showed the higher ability of replication. PRRSV-1 stains showed to avoid the correct innate immune response in infected pigs through lymphatic cell depletion, IFN-α and TNF-α down-regulation in Med-LN compartments. Finally, the IL-10 induction by PRRSV was not a common strategy among the PRRSV-1 to delay of the host immune response.
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    Impact of melon EIF4E editing on virus resistance and melon fertility
    (Universidad de Murcia, 2022-05-12) Pechar, Giuliano Sting; Aranda Regules, Miguel Ángel; Donaire Segarra, Livia; García-Almodóvar, Roque Carlos; Escuela Internacional de Doctorado
    En este trabajo se ha estudiado el impacto de la edición del gen que codifica el factor de iniciación de la traducción eucariota (eIF) 4E sobre la susceptibilidad a virus y la fertilidad de la flor masculina en melón. EIF4E es una proteína de unión a cap que, a través de su interacción con eIF4G, constituye el núcleo del complejo eIF4F, el cual desempeña un papel clave en la circularización de los ARN mensajeros y su posterior traducción cap-dependiente. Además de su papel fundamental en la traducción de ARNm en eucariotas, eIF4E ha sido descrito como factor de susceptibilidad a virus de plantas, ya que puede ser reclutado por estos, permitiendo el establecimiento de la infección. Más allá de su papel en la traducción canónica de los ARNm celulares, se han sugerido otras funciones para eIF4E en la biología de los organismos eucariotas, incluido el desarrollo sexual. En la primera sección de los resultados, se describe la generación de un mutante knock-out de EIF4E mediante CRISPR/Cas9. Las líneas mutantes T0 mostraron una deleción de un solo nucleótido en homocigosis que dio lugar a una proteína eIF4E truncada; además, la supresión de EIF4E originó un fenotipo de androesterilidad. El cruce entre plantas transgénicas homocigotas para la mutación con plantas de tipo silvestre del mismo genotipo dio lugar a una generación F1 que incluía individuos no transgénicos que presentaban la misma deleción que en la T0, pero en heterocigosis. A continuación, se fecundaron individuos F1 fértiles no transgénicos para obtener una generación F2 libre de transgen. Las plantas de la generación F2 fueron inoculadas con el virus del mosaico de la sandía marroquí (MWMV); las plantas homocigotas para la mutación de EIF4E mostraron resistencia al virus, mientras que las plantas heterocigotas y las no mutantes mostraron síntomas de la enfermedad. Tras cuatro meses desde la inoculación, se observaron síntomas de infección por MWMV en dos de las plantas resistentes. Estas plantas sintomáticas fueron positivas para MWMV por RT-qPCR, por lo que se realizó un ensayo de retroinoculación que confirmó la presencia de un aislado que superaba la resistencia (RB). A continuación, se amplificó por RT-PCR el gen de la VPg del MWMV y se identificó una única sustitución de un nucleótido que daba lugar al cambio de aminoácido N163Y en el aislado RB. Dados los antecedentes publicados sobre la superación de la resistencia mediada por el eIF4E en potyvirus, es muy probable que la mutación N163Y en la VPg del MWMV sea la responsable de la superación de la resistencia de las plantas editadas de melón. En cuanto a la fertilidad, todas las plantas homocigotas, y sólo ellas, mostraron el fenotipo de esterilidad masculina observado en T0. En el segundo apartado de los resultados de este trabajo, se realizó el análisis morfológico y transcriptómico de las flores de melón en diferentes etapas de desarrollo. En primer lugar, se analizó la morfogénesis de las flores masculinas y hermafroditas, identificando mediante microscopía óptica y de barrido 12 estadios de formación floral, que van desde la aparición de los meristemos florales hasta la antesis. Las primeras diferencias estructurales entre las flores masculinas y hermafroditas aparecieron entre los estadios 6 y 7, por lo que se ha llevado a cabo una descripción de las etapas que conducen a la formación de los órganos y estructuras en ambos tipos de flores. Por último, se identificaron los patrones de expresión de los genes que son específicos de un episodio determinado, identificando aquellos que definen el paso de un episodio al siguiente según el modelo ABCDE de desarrollo floral. En la tercera parte de este trabajo, se llevó a cabo un análisis comparativo del desarrollo floral masculino entre las plantas de tipo silvestre y las mutantes knock-out de EIF4E, con el fin de investigar el papel de EIF4E en la formación de los gametos masculinos del melón. El análisis comparativo de las anteras realizado mediante microscopía mostró que el fenotipo de esterilidad es post-meiótico y esporofítico, ya que la inusual secreción de material proteico, y las diferencias en la degradación del tapetum entre el mutante y el WT, son característicos de este tipo de esterilidad. En consonancia con esto, los datos transcriptómicos identificaron una regulación a la baja de los genes implicados en el desarrollo del tapetum y en la germinación del polen en las flores masculinas del mutante de EIF4E frente al WT. Por último, EIF4G mostró un patrón de regulación a la baja a lo largo del desarrollo floral masculino en el mutante con respecto al WT. Dada la evidencia que apoya un papel diferencial de las isoformas de eIF4F en la traducción de los mRNAs en las células germinales, se propuso que la interacción entre eIF4E y eIF4G es un requisito previo para la traducción de los mRNAs que codifican las proteínas que limitan la formación de los gametos masculinos.
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    Implications of mixed infections of two strains of a plant virus on its epidemiology, evolution and interaction with the host
    (Universidad de Murcia, 2022-05-24) Alcaide Cabello, Cristina; Aranda Regules, Miguel Ángel; Gómez López, Pedro; Escuela Internacional de Doctorado
    El virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) es un potexvirus de ARN monocatenario de polaridad positiva que afecta a cultivos de tomate en todo el mundo. En esta tesis he estudiado las interacciones virus-virus y virus-huésped en infecciones mixtas de aislados de PepMV de dos cepas distintas. Estas interacciones virus-virus y virus-huésped pueden variar dependiendo del aislado del virus, el tipo de infección y la ecología del huésped. En primer lugar, en cuanto a la estructura poblacional de PepMV en el sureste español, se observó que los aislados de PepMV-CH2 eran predominantes, mientras que los aislados de PepMV-EU persistían principalmente en infecciones mixtas. Además, este patrón epidemiológico difirió entre dos zonas geográficamente cercanas, observando una mayor variabilidad genética en la población de PepMV-CH2 donde las infecciones mixtas estuvieron co-circulando. Hasta el momento, se había descrito una interacción antagonista in planta entre un aislado de la cepa Chilena (CH2) y un aislado de la cepa Europea (EU), en la cual se reprimía la acumulación de PepMV-CH2 durante la infección mixta. Se comprobó que esta interacción antagonista ocurría con distintos aislados CH2, independientemente de su procedencia. Posteriormente, se estudió el efecto que un factor abiótico, como la temperatura, podría tener sobre la interacción entre PepMV-EU y PepMV-CH2. Por un lado, se observó que variaciones en la temperatura podían afectar la acumulación viral, siendo la infección por PepMV más productiva a la temperatura más baja (20ºC versus 30ºC). A su vez, el tiempo también tuvo un papel en la interacción entre PepMV-EU y PepMV-CH2, ya que a largos tiempos post-inoculación se dejó de observar la interacción antagonista entre ambos aislados. En cuanto a la carga mutacional, el número medio de variantes en las poblaciones virales se incrementó significativamente con la temperatura, siendo a su vez dependiente de aislado. En este trabajo también se ha estudiado el papel de las sobre-infecciones en el antagonismo asimétrico mostrado por PepMV-EU y PepMV-CH2. PepMV-EU tuvo un efecto protector frente a la infección de PepMV-CH2, sin embargo, la acumulación de PepMV-EU se incrementó en plantas pre-inoculadas con PepMV-CH2. En cuanto al efecto del tipo de infección (simple o mixta) sobre la transmisión viral, se observó una fuerte correlación positiva entre acumulación viral y transmisión, independientemente del tipo de infección que presentaba la fuente de inóculo. También se analizó la diversidad genética de PepMV-EU y PepMV-CH2 en infecciones simples y mixtas en un experimento de pases seriados. Para PepMV-EU, no se encontraron diferencias significativas en el número de sustituciones nucleotídicas entre infecciones simples y mixtas. Sin embargo, se encontró un mayor número de sustituciones en infecciones simples de PepMV-CH2 en comparación con infecciones mixtas. Comparando PepMV-EU y PepMV-CH2, se encontró una mayor diversidad nucleotídica para la población de PepMV-CH2. Por último, en un intento por comprender los mecanismos subyacentes a la interacción virus-virus entre PepMV-EU y PepMV-CH2, se llevó a cabo un análisis transcriptómico de plantas de tomate infectadas con PepMV-EU, PepMV-CH2 o ambos. En primer lugar, se compararon los transcriptomas de plantas con infecciones simples, mostrando que cada cepa viral modulaba diferencialmente el transcriptoma del huésped, así como que las alteraciones transcriptómicas más pronunciadas se producían a tiempos tempranos post-infección. También se demostró que las infecciones mixtas difirieron de las infecciones simples en la respuesta transcriptómica del huésped a tiempos tardíos post-inoculación. Se realizó una búsqueda de genes del huésped que pudieran estar potencialmente implicados en el antagonismo entre PepMV-EU y PepMV-CH2. Se determinó que los genes AGO1a, DCL2d, AGO2a y DCL2b, los cuales están implicados en la ruta de silenciamiento antiviral, fueron regulados al alza durante la infección por PepMV-EU, pero no por PepMV-CH2, a tiempos tempranos post-infección. El patrón de expresión de AGO2a se validó en plantas de tomate y de Nicotiana benthamiana; sin embargo, aunque las plantas mutantes ago2 de N. benthamiana fueron híper-susceptibles a PepMV, no mostraron un cambio en el patrón de antagonismo asimétrico entre PepMV-EU y PepMV-CH2.