Browsing by Subject "Citología. -Tesis doctorales. Animales-Reproducción-Tesis doctorales."

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    Molecular determinants involved in conceptus elongation in ungulates
    (Universidad de Murcia, 2024-11-08) Pérez Gómez, Alba; Bermejo Álvarez, Pablo; Ramos Ibeas, Priscila; Jiménez Movilla, María; Escuela Internacional de Doctorado
    El desarrollo embrionario de los ungulados –grupo que incluye a las principales especies de mamíferos de interés ganadero– se caracteriza por un periodo preimplantacional largo que puede dividirse en dos fases. La primera abarca desde la fecundación hasta la eclosión del blastocisto y es común a todos mamíferos, siendo la única fase presente en ratones y humanos, en los que el embrión implanta justo después de la eclosión. En contraste, el desarrollo preimplantacional de los ungulados se extiende en una segunda fase denominada elongación del concepto. La elongación del concepto se caracteriza por la proliferación masiva de las membranas extraembrionarias y por la formación de un disco embrionario plano en el que tiene lugar la gastrulación antes de la implantación. La elongación del concepto es el periodo más susceptible a pérdidas embrionarias y, por ello, el estudio de los procesos que tienen lugar durante esta fase es crucial para reducir las pérdidas embrionarias en animales de granja y aporta información relevante para entender el desarrollo embrionario humano. Esta tesis, dividida en cinco capítulos, analiza diferentes aspectos moleculares del desarrollo preimplantacional bovino, centrándose en la fase de la elongación del concepto. El Capítulo 1, describe importantes diferencias en el desarrollo embrionario preimplantacional entre diferentes especies de mamíferos, detallando distintos marcadores específicos de linaje que pueden utilizarse para evaluar la calidad embrionaria en ungulados. En el resto de los capítulos se emplea la tecnología de edición génica CRISPR/Cas9 para realizar estudios de pérdida de función que sirven para conocer la función de genes específicos durante el desarrollo preimplantacional. Los experimentos emplean aproximaciones in vitro –incluyendo un novedoso sistema de desarrollo post- eclosión– e in vivo para determinar la capacidad de desarrollo de los embriones knock- out (KO). Los capítulos 2 y 3 analizan la capacidad de desarrollo de embriones bovinos dobles portadores de haplotipos deletéreos, que son alelos que causan mortalidad embrionaria o fetal en homocigosis. El capítulo 2 estudia la capacidad de desarrollo de embriones dobles portadores del Haplotipo Holstein 3 (HH3), que consiste en una sustitución T/C que impide la formación de la proteína SMC2 funcional. SMC2 es un componente esencial de complejos proteicos que median el ensamblaje y segregación de los cromosomas durante la mitosis y meiosis. En un primer estudio se vio que los embriones dobles portadores del haplotipo no eran capaces de desarrollarse hasta día embrionario (E) 14. Para precisar cuándo se producía el arresto en el desarrollo, se generaron embriones KO para SMC2 (funcionalmente equivalentes a los dobles portadores HH3) mediante la tecnología CRISPR. Los embriones KO para SMC2 fueron capaces de alcanzar el estadio de blastocisto, pero mostraron una clara disminución de la proliferación celular y no consiguieron sobrevivir hasta Día (D) 12 in vitro, no siendo capaces de inducir el reconocimiento materno de la gestación. El Capitulo 3 evalúa la capacidad de desarrollo de embriones dobles portadores del Haplotipo Holstein 5 (HH5), que carecen de la proteína TFB1M, implicada en la traducción mitocondrial. Inicialmente, se observó que los embriones dobles portadores mostraban un defecto severo en la proliferación de las membranas extraembrionarias a E14. Para estudiar su capacidad de desarrollo en estadios previos, se generaron embriones KO para TFB1M, funcionalmente equivalentes a los dobles portadores HH5. Los embriones KO para TFB1M no mostraron ningún defecto en el desarrollo hasta D12 in vitro, indicando que el desarrollo de los embriones dobles portadores de HH5 se detiene en la transición entre concepto esférico y tubular, antes del reconocimiento de la gestación. El Capítulo 4 analiza la función durante el desarrollo embrionario del receptor de señalización lipídica PPARG. Para ello, se analizó el desarrollo de embriones bovinos KO para PPARG en D8 y D12 in vitro y se realizaron transferencias embrionarias heterólogas para evaluar su capacidad de desarrollo in vivo durante las primeras etapas de la elongación. Los embriones sin PPARG fueron capaces de desarrollarse normalmente hasta estadios elongados equivalentes a E14, mostrando que la señalización mediada por PPARG en el embrión no es necesaria para la elongación temprana del concepto bovino. Finalmente, el capítulo 5 explora un dogma de la biología del desarrollo establecido en base al modelo de ratón: el papel esencial del factor de transcripción TEAD4 en la diferenciación del trofoectodermo y la formación del blastocisto. Siguiendo un diseño experimental similar al del capítulo 4, se observó que los embriones bovinos KO para TEAD4 se desarrollaron de forma normal hasta el estadio de blastocisto in vitro y fueron capaces de alcanzar estadios tardíos de desarrollo (concepto tubular de E14) in vivo sin mostrar defectos evidentes en la proliferación del trofoectodermo. También se observó que TEAD4 tampoco era necesario para la diferenciación del trofoectodermo y formación del blastocisto en conejos, una especie que comparte el mismo clado (Glires) que los roedores. Estos resultados prueban que el papel crucial de TEAD4 en la diferenciación del trofoectodermo es exclusivo de roedores.