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    Aislamiento y caracterización de células madre de membrana anmiótica murina
    (2018-01-09) García Guillén, Ana Isabel; Marín Atucha, Noemí; García Bernal, David; Facultad de Medicina
    RESUMEN Introducción: Las células madre derivadas de membrana amniótica humana han demostrado poseer características importantes de proliferación, diferenciación multipotencial, inmunomodulación e immunotolerancia. Estas características, unidas al hecho de tratarse de un tejido desechable tras el parto, las convierte en un objeto interesante en medicina regenerativa. Objetivos: Aislar y caracterizar las células madre de membrana amniótica murina (MAm), estudiando para ello la expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales, de pluripotencialidad y proliferación, y sus propiedades inmunomoduladoras. Estudiar su aplicación terapéutica en un modelo murino de hemofilia A severa. Metodología: Tras el aislamiento de la MAm a partir de ratones hembras gestantes C57BL/6, se llevó a cabo el estudio histológico y expresión de diversos marcadores de células madre en el tejido aislado mediante PCR e inmunofluorescencia. Seguidamente, se obtuvieron las diferentes poblaciones celulares de la MAm para el estudio de su cultivo realizando ensayos de proliferación, clonogenicidad, el análisis del ciclo celular y estudios de capacidad multipotencial e inmunomoduladora. Además, en los cultivos, se analizó la expresión de diversos marcadores mediante PCR, citometría e inmunofluorescencia. Las células derivadas de MAm fueron empleadas como terapia celular en un modelo murino de hemofilia A severa. Para ello, se realizó el trasplante celular por vía intraportal o intraperitoneal, sacrificando los animales desde 1 semana hasta 1 año tras el trasplante. Resultados: La MAm consta de una capa de células epiteliales y una subcapa de células mesenquimales estromales, con expresión de sus marcadores específicos, marcadores de pluripotencialidad y proliferación, además de factor VIII (FVIII) y factor von Willebrand de coagulación. Tras el aislamiento de las células, se obtuvieron dos tipos celulares: un cultivo de células de tipo epitelial y un cultivo de células CD44+. Las células de tipo epitelial mostraron tendencia a la senescencia en cultivo, expresión negativa para marcadores hematopoyéticos y positiva para marcadores de células madre epiteliales y de pluripotencialidad. Estas células también mostraron una expresión positiva de marcadores de células madre mesenquimales en algunos pases del cultivo, y fueron capaces de diferenciarse a células de la capa mesodérmica. Las células CD44+ mostraron una alta capacidad de proliferación, una capacidad multipotencial que se mantuvo en cultivo, y una expresión de marcadores de pluripotencialidad, de proliferación y de células madre mesenquimales como vimentina, CD90, CD105 y CD73. Además, presentaron capacidad clonogénica e importantes propiedades inmunomoduladoras, siendo capaces de inhibir la proliferación de linfocitos T de una manera dosis dependiente. Finalmente, el trasplante alogénico de MAm en los animales con hemofilia A dio lugar a la expresión positiva para FVIII en el tejido hepático de los animales trasplantados desde 1 semana hasta 12 meses tras el trasplante. Conclusiones: La MAm está formada por células madre epiteliales y mesenquimales con capacidad multipotencial y de proliferación en cultivo. Las dos poblaciones de MAm estudiadas en cultivo, presentaron características similares a las células madre epiteliales y mesenquimales respectivamente. Las células de la MAm sintetizaron FVIII y sobrevivieron hasta 12 meses tras su trasplante alogénico en el modelo de hemofilia A severa, pudiendo ser consideradas como una herramienta terapéutica para dicha enfermedad. ABSTRACT Introduction: Human amniotic membrane has been previously described as a high throughput source for stem cells with capacity for proliferation and multipotent differentiation, reduced immunogenicity, and potent inmmunomodulatory properties. All of these characteristics make it a suitable cell source for further regenerative medicine approaches. Objectives: The main objective of this study was to isolate and characterize the murine amniotic stem cells in order to analyze their biological properties and specifically their pattern of expression of epithelial and mesenchymal markers, multipotent capacity and their inmunomodulatory properties in vitro, as well as their therapeutic efficacy in a murine model of haemophilia A. Methods: Amniotic membranes from pregnant females C57BL/6 mice (mAM) were carefully separated from the yolk sacs and collected. We carried out histological assays with whole mAMs as well as to study the expression of specific markers by PCR and inmunofluorescence. The different cell populations were isolated from the mAM and characterized by different techniques such as flow cytometry, inmunofluorescence and PCR. Furthermore, proliferation, differentiation capacity, cell cycle and clonogenic assays were performed. Moreover, the immunosuppressive capacity of the mAM cells was tested by using mixed lymphocyte cultures with allogeneic stimulator BALB/c and responder C57BL/6 splenocytes, cultured in presence of different ratios of mAM stem cells. Importantly, these cellular populations were used in a preclinical study of haemophilia A to analyze their therapeutic efficacy. In order to find out the more efficient route of administration of the cells, we performed intraportal and intraperitoneal transplants into the animals. Results: Two different types of cells were detected in freshly mAM, epithelial and mesenchymal stem cells. Both cell types expressed specific epithelial and mesenchymal markers, pluripotent and proliferation markers and also expressed the coagulation factors FVIII and von Willebrand factor. After setting up the most appropriate cell isolation protocol, we obtained two different types of cultures: one of epithelial-like cells and a CD44+ population cell culture. Epithelial-like cells showed signs of senescence at early passages in culture, negative expression for hematopoietic markers and positive for pluripotent and epithelial cell markers, although they also expressed mesenchymal markers in some culture passages. Furthermore, these cells were able to differentiate into lines of the mesoderm layer. On the other hand, CD44+ cells showed a high proliferation capacity and multipotent ability in all the studied culture passages. They expressed pluripotent, proliferative and other mesenchymal markers such as vimentine, CD90, CD105, and CD73. In addition, CD44+ cells displayed adequate clonogenic properties and induced a dose-dependent inhibition of the proliferation of activated C57BL/6 splenocytes in an allogeneic context. Finally, the mAM cell transplant into the haemophilic mice led to factor VIII expression in the hepatic tissue of the transplanted animals from 1 week up to 12 months post-transplant. Conclusions: mAM is composed by epithelial and mesenchymal stem cells that showed multipotent and proliferation properties in vitro. The population of epithelial-like cells displayed similar characteristics to epithelial stem cells, and at the same time, the population of CD44+ cells had similar characteristics to mesenchymal stem cells from other sources. Treatment with mAM stem cells in haemophilia A mice led to factor VIII gene expression, as well as to the production of the factor VIII protein in the liver of the transplanted haemophilic animals. Together, mAM may represent a rich source of pluripotent stem cells with immunomodulatory properties that could be effective for their therapeutical use in multiple murine preclinical studies in order to develop future human therapies.
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    Aislamiento y caracterización de las células madre de la membrana amniótica: una nueva fuente para terapia celular e inmuno-modulación
    (2012-05-15) García de Insausti, Carmen L; Moraleda Jiménez, José María; García-Estañ López, Joaquín; Facultad de Medicina
    Se realizó el aislamiento y caracterización de las células de 20 membranas amnióticas. De cada MA se obtuvo un promedio de 123±12x106 células epiteliales (hAEC) y 5.3x106 células mesenquimales (hAMSC). Las hEAC expresaron SSEA (1, 3 y 4), y TRA (1-60 y 1-81). Las hAMSC expresaron CD73, CD90, CD105 y no CD34, CD45, CD14 ni CD19. Ambas fueron negativas para HLA DR y positivas para transcriptos de Nanog, Oct-4 y Sox-2. En los cultivos primarios las hAEC mostraron menor capacidad de auto-renovación y proliferación que las hAMSC, y en los sub-cultivos desarrollaron Transición Epitelio-Mesénquima. Todas las hAEC mostraron potencialidad para diferenciarse en células de las tres capas germinales (neuroectodérmicas, hepatocíticas y cardiomiocíticas), algunas para diferenciación osteogénica y adipogénica, y ninguna para condrogénica. Todas las hAMSC se diferenciaron hacia líneas osteogénicas, adipogénicas y condrogénicas. En conclusión, la MA representa un reservorio de células madre pluripotenciales y multipotenciales inmunológicamente privilegiadas. In this study we determine the quantity and quality of amnion cells after isolation and culture from 20 placentas. Following our protocol, primary yields were 123 ±12 x 106 hAECs and 5.3x106 hAMSCs. Flow cytometric characterization showed expression of SSEA (1, 3 and 4) and TRA (1-60 and 1-81) in hAECs. hAMSC expressed CD73, CD90, CD105 and none CD45, CD34, CD14, CD19. Both cells types were negative for HLA-DR and exhibited Nanog, Oct-4 and Sox-2 transcripts. In primary cultures hAECs showed slower proliferation and less clonogenic capacity than hAMSCs, in sub-cultures they exhibited Epithelial Mesenchymal Transition. All hAECs samples were induced to differentiate into neuroectodermal, hepatic and cardiomiocitic cells, while osteogenic y adipogenic capacity varied between them. All hAMSCs samples exhibited osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation capacity. In conclusion, term amnion may be a useful source of pluripotent and multipotent stem cells that possess a degree of immune privilege.
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    Caracterización de células madre de la membrana timpánica : estudio de su localización anatómica en modelo animal
    (2016-01-15) Moraleda Deleito, Javier; Moraleda Jiménez, José María; Marín Atucha, Noemí; Castellanos Escrig, Gregorio; Departamento de Medicina Interna
    Objetivos: La membrana timpánica (MT) tiene capacidad de repararse fisiológicamente tras traumatismos, infecciones y otras patologías. Es lógico deducir que existe un nicho de células madre con capacidad regenerativa responsable de la reparación tisular a este nivel, pero existe muy poca información contrastada sobre ello. Nuestro objetivo fue confirmar la existencia y localización de células madre de la MT y realizar su aislamiento y caracterización. Metodología: Se utilizo un modelo murino C57BL/6J de 8-10 semanas, procedente del animalario de la Universidad de Murcia, siguiendo normativa vigente. Para extracción de MT se utilizaron varios protocolos quirúrgicos con inclusión o ausencia de martillo y annulus. Se realizaron técnicas de digestión enzimática y explantes para obtención de cultivo primario. Las células se sembraron a 1,25 x106 en frascos de cultivo de 25cm2 con alfa-MEM suplementado según protocolos estandarizados en estufas a 37ºC y 5% de C02. Se realizaron subcultivos, curvas de crecimiento y cuantificación de la proliferación celular con MTT. Se utilizó citómetro FACSCanto y un panel de 8 Ac monoclonales para la tipificación inmunofenotípica y RT-PCR para expresión de Nestina, Nanog y Slug. Se emplearon medios de cultivo específicos para la capacidad de diferenciación multipotente. El estudio del nicho se realizó mediante cortes histológicos en zonas estructuradas de la MT y análisis histológico convencional e inmuno-histoquímico para Ki-67, Nestina, Tuj-1 y Oct-3/4. Resultados: Se extrajeron 333 tímpanos de 207 ratones, de los que se lograron realizar 25 explantes. La digestión enzimática produjo una baja viabilidad y escasa proliferación celular en relación directa con el tiempo de exposición. En contraste las técnicas de explante produjeron una viabilidad >75% alcanzándose confluencia más rápidamente y durante mayor número de pases que con colagenasa. Los mejores explantes para cultivos primarios incluyeron el martillo y el annulus. En los cultivos primarios se observaron células de morfología epitelial y otras células de morfología fibroblástica. Las curvas de crecimiento demostraron un promedio de 3,54x105 en los explantes con martillo y annulus en comparación con 2,9 x105 y 3,1 x105 en los que no incluyeron annulus. El MTT mostró una proliferación exponencial proporcional al tiempo de cultivo y a la densidad de la muestra inicial. Las células de la MT fueron negativas para CD45, CD19 y citoqueratina, y positivas para CD90, CD105, CD73, (marcadores mesenquimales), así como para Ki67 y Nestina (marcadores de proliferación e inmadurez). Fueron parcialmente positivas para CD34. La PCR mostró positividad para Nanog, Slug y Nestina. La diferenciación adipocítica se demostró por la presencia de tinción celular positiva para Oil Red O; la diferenciación osteocítica por los depositos de calcio Alizarin red, tinción positiva de fosfatasa alcalina e inmunofluorescencia para osteopontina, y diferenciación condrocítica con inmunofluorescencia positiva a colágeno II. Los estudios histológicos fueron positivos para Ki67, Nestina y Oct-3/4 no así como para Tuj-I. Los nichos de células con características de células madres se encontraron en las áreas de engrosamiento de la membrana timpánica junto al mango del martillo y al annulus. Conclusiones: Nuestros datos confirman la presencia en la membrana timpánica de células progenitoras inmaduras con características de células madre. Las células madre de la MT se sitúan preferentemente en la zona de inserción del mango del martillo, y con menor frecuencia en el annulus. La técnica optima de explante para la obtención de cultivos primarios eficaces debe incluir el martillo y el annulus. Las células obtenidas del cultivo de la MT identificadas en nuestro estudio, tienen capacidad de diferenciación multipotencial a líneas celulares mesodérmicas y presentan un fenotipo inmunológico, compatibles con la definición de células madre mesenquimales aceptada por la ISCT, por lo que podrían emplearse en ensayos de terapia celular. Goals: The tympanic membrane (TM) has the ability to repair after trauma, infections and other diseases. It is logical to conclude that there is a niche of stem cells with regenerative capacity responsible for tissue repair at this level, but there is little authoritative information about it. Our aim was to confirm the existence and location of these cells within the TM and to try to isolate and characterize them. Methododology: An 8-10 weeks mouse model C57BL/6J from the animal facility of the University of Murcia was used following current regulations. For the TM extraction, various surgical protocols were used including combinations of hammer or and annulus extractions. Different techniques were performed to obtain primary cultures including explants and enzymatic digestion. Cells were seeded at a concentration of 1.25 x 106 in 25cm2 culture flasks with alpha-MEM supplemented by standardized protocols in a stove at 37C with 5% C02. Subcultures, growth curves and quantification of cell proliferation was performed with MTT. A FACSCanto cytometer with a panel of 8 monoclonal Antibodies was used for immunophenotypic characterization and RT-PCR for expression of Nestin, Nanog and Slug. Specific culture media for multipotential differentiation capacity were used. To localize the stem cell niche structured sections of different TM areas were performed using conventional histological staining and immunohistochemical analysis for Ki-67, Nestin, Tuj-I and Oct-3/4. Results: 333 eardrums of 207 mice were extracted, of which we were able to perform 25 explants. Enzymatic digestion produced a low viability and low cell proliferation in direct relation to the exposure time. In contrast explants techniques produced viability greater than 75% with confluence being reached more quickly and for most passes compared with collagenase. The best explants for primary cultures included the hammer and the annulus. In primary cultures cell with epithelial and fibroblast morphology were observed. The growth curves showed an average 3,54x105 cells in explants of hammer and annulus compared to 3.1x105 and 2.9x105 cells in the two explants that didn’t include annulus. The MTT showed proportional exponential proliferation to the time of cultivation and initial cell density. TM cells were negative for CD45, CD19 and cytokeratin, and positive for CD90, CD105, CD73, (mesenchymal markers) and Nestin and Ki67 (proliferation markers and immaturity). They were partially positive to CD34. The PCR was positive for Nanog, Slug and Nestin. Adipocyte differentiation was demonstrated by the presence of cell staining positive for Oil Red O. The osteocytic differentiation by calcium deposits Alizarin red, positive staining of alkaline phosphatase and immunofluorescence for osteopontin. Chondrocyte differentiation by collagen II was positive in immunofluorescence. Histological studies were positive for Ki-67, Nestin and Oct-3/4 and not to Tuj-I. Cells with characteristics of stem cells were found in the areas of thickening of the tympanic membrane near the handle of malleus and the annulus. Conclusions: Our data confirms the presence in the TM of immature progenitor cells with stem cell characteristics. TM stem cells are preferably located in the insertion of the handle of the malleus, and less frequently in the annulus. The optimum explants technique for obtaining efficient primary cultures should include hammer and annulus. The cells obtained from culture of TM identified in our study, have multipotential differentiation capacity to mesodermal cell lines and express a immunological phenotype compatible with the definition of mesenchymal stem cells accepted by the ISTC, so could be used in for cell therapy.
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    Células madre mesenquimales de médula ósea fucosiladas : ¿es posible una producción a escala clínica?
    (2016-02-09) López Lucas, María Dolores; Moraleda Jiménez, José María; García Hernández, Ana Mª; Castellanos Escrig, Gregorio; Facultad de Medicina
    En los últimos años se han publicado datos esperanzadores sobre la seguridad y potencial eficacia de las CSM como medicamento de terapia celular en multitud de patologías de diferente etiología (Pastor D 2012, Pastor D 2013, Perez-Simon JA 2011, Sanchez PL 2007, Garcia-Olmo D 2005, Garcia-Olmo D 2009, Lee RH 2006, Le BK 2003, Le BK 2005 Rodriguez-Lozano FJ 2012). Uno de los principales factores que puede estar limitando la generalización de estos buenos resultados clínicos es, en el caso de ensayos con administración intravenosa de las CSM, que son pocas las células que finalmente alcanzan el tejido diana. El Dr. Robert Sackstein demostró por primera vez que la afinidad de las CSM por el endotelio vascular se incrementaba significativamente mediante la fucosilación enzimática del antígeno de CD44 presente en la superficie de las CSM. Este hecho abría la posibilidad de mejorar el rendimiento de su infusión intravenosa y por tanto su eficacia terapeútica (Thankamony SP 2011, Sackstein R 2011, Sackstein R 2011, Sackstein R 2012). La traslación de esta tecnología al paciente como medicamento a ensayar en programas clínicos de terapia celular requiere su fabricación en una unidad de producción celular o “sala blanca”. Esta unidad ha de ser certificada, en el caso de nuestro país, por la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios. El Servicio de Hematología del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca cuenta con una Unidad de producción celular (UPC) integrada como plataforma del Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB). Nuestro grupo de investigación colabora desde hace años con el Dr. Sackstein y hemos reproducido y validado sus experimentos de fucosilación en modelos animales en nuestro laboratorio (Cabañas-Perianes V 2013, García Hernández A 2013, Moraleda JM 2013). En base a lo anteriormente expuesto, el objetivo general de este trabajo fue validar un protocolo de expansión y fucosilación de CSM de médula ósea humanas a escala clínica siguiendo las normas de correcta fabricación de medicamentos. Como objetivos específicos se encontraba poner a punto la técnica de fucosilación sin derivados de origen animal, comprobar si la traslación de los protocolos básicos de expansión y fucosilación a escala clínica es posible, generando toda la documentación necesaria para la producción GMP, validar el proceso aséptico y el proceso de producción y verificar el cumplimiento de las especificaciones de los lotes fabricados durante esta etapa de validación. Para llevar a cabo los objetivos anteriores se estableció la siguiente metodología: – Puesta a punto del cultivo y fucosilación de CSM-MO cultivadas sin empleo de derivados animales. – Elaboración de la documentación necesaria para la realización del protocolo clínico. – Simulación del proceso aséptico Media Fill. – Validación prospectiva del proceso de producción. – Controles de Calidad del medicamento durante el proceso de fabricación. Con los resultados obtenidos se puede concluir que: – Las células CSM-MO se fucosilan eficazmente, expandidas con nuestro protocolo de cultivo, sin aditivos de origen animal y utilizando lisado plaquetario. – La documentación elaborada para producir el medicamento CSM-MO fucosiladas a gran escala y en condiciones GMP se ha llevado a cabo con éxito y cumple las exigencias de la normativa vigente. – La simulación del proceso de fabricación del medicamento CSM-MO fucosiladas en grado GMP se realiza en completa esterilidad por todos los operadores que participan en el proceso de producción. – Se ha conseguido validar el proceso de producción del medicamento CSM-MO fucosiladas en grado GMP. – El medicamento CSM-MO fucosiladas en nuestra sala de producción celular es apto para su uso clínico ya que cumple con las especificaciones establecidos en base a las normas de correcta fabricación. Encouraging data about the safety and efficacy potential of mesenchymal stem cells (MSC) as a cell therapy medicine has been published in the last years regarding many diseases with different etiologies (Pastor D 2012, Pastor D 2013, Perez-Simon JA 2011, Sanchez PL 2007, Garcia-Olmo D 2005, Garcia-Olmo D 2009, Lee RH 2006, Le BK 2003, Le BK 2005 Rodriguez-Lozano FJ 2012). One of the main limiting factors impairing the generalization of such clinical results, when the clinical MSC requires an intravenous administration, is the small amount of cells that finally reach the target tissue. Dr. Robert Sackstein demonstrated, for the first time, that the affinity of the MSC for the vascular endothelium significantly increases when the CD44 present in their membrane is fucosylated. This fact opens the possibility to improve the results of their i.v. infusion and its therapeutic efficacy (Thankamony SP 2011, Sackstein R 2011, Sackstein R 2011, Sackstein R 2012). A Cell Production Unit is required to translate this technology to the patient, as a medicine to be tested in clinica trials. This kind of Unit has to be certified in Spain by the Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios. The Hematology Service of the Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca has a Cell Production Unit integrated as a platform in the Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB). Our research group has a long lasting collaboration with Dr. Sackstein, and has reproduced and validated in our laboratories his fucosylation experiments in animal models (Cabañas-Perianes V 2013, García Hernández A 2013, Moraleda JM 2013). Our objective in this work was to validate a clinical scale human bone marrow MSC (BM-MSC) expansion and fucosylaton protocol following the Good Manufacturin Practices of medicines. Our specific objectives were to set up an animal derived free fucosylation technique, to test whether the basic expansion and fucosylation protocols can be translated into a clinical scale production, creating all the documentation required for a GMP production, to validate the aseptic procedure and the production process, and to verify the batches manufactured during this validation stage fulfillment of the specifications. To carry out these objectives, the following methodology was established: – Set up the animal derived free BM-MSC culture and fucosylation. – To elaborate the documentation required for the clinical protocol. – Media Fill simulation of the aseptic procedure. – Prospective validation of the production process. – Quality controls of the medicine during the production process. Our results allow us to conclude that: – BM-MSC con be effectively fucosylated and expanded with our animal derived free culture, using platelet lysate. – The documentation elaborated to produce at clinical scale and under GMP conditions the fucosylated BM-MSC medicine has been successful and meets the requirements of current legislation. – The fucosylated BM-MSC manufacturing process simulation has been performed in a sterile fashion by all the operators that participate in the manufacturing process. – The GMP grade fucosylated BM-MSC medicine production process has been validated. – The fucosylated BM-MSC medicine manufactured in our Cell Production Facility can be clinically used, as it meets all the specifications established following the Good Manufacturing Practices.
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    Conferencia: 'Using stem cells to treat retinal degenerative diseases'
    (2010-05-18) Urbina, Luis
    Conferencia: 'Using stem cells to treat retinal degenerative diseases', a cargo del profesor Raymond Douglas Lund.
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    Empleo de células madre en el tratamiento de lesiones tendinosas en el caballo de deporte
    (Universidad de Murcia, 2014) Diego, R.
    Los caballos presentan un potente aparato tendinoso en la región distal de sus extremidades que se originan en los sistemas musculares que se disponen proximalmente al carpo o tarso y se insertan en la falange distal. Como consecuencia de las exigencias deportivas a las que están sometidos los caballos, son frecuentes las lesiones tendinosas que comprometen su vida deportiva. Tradicionalmente, el tratamiento se ha basado en regeneradores de la matriz extracelular (polisulfato glicosaminoglicano, ácido hialurónico) o inhibidores del colágeno (β-aminopropionitrilo de fumarato) combinado con reposo, con unos resultados limitados. Es por ello que en la última década se han desarrollado opciones terapéuticas basadas en la medicina regenerativa y la terapia celular, permitiendo la recuperación funcional de la estructura lesionada mediante el uso de células madre mesenquimales (MSCs). En este artículo se revisa el estado actual de la terapia celular con MSCs como tratamiento de lesiones tendinosas en caballos de deporte. A nivel de terapia celular destaca el uso de células madre mesenquimales de origen óseo y adiposo, con unos resultados de recuperación realmente alentadores con respecto a caballos mantenidos en reposo, que se traduce en la presencia en la zona lesionada de un mayor porcentaje de colágeno tipo I, menor cantidad de agua y glucosaminoglicanos y disminución del infiltrado inflamatorio; también se ha descrito un aumento en la neovascularización. En cuanto a las propiedades biomecánicas, los tendones tratados con células madre tienen menor rigidez y mejor organización fibrilar que los tratados de forma clásica, apreciándose también mejoras en la elasticidad. Los datos que ofrecen los últimos estudios, muestran que de los animales tratados con MSCs (n=113), el 98,2% volvió a la vida deportiva. De este 98,2% de caballos, el 27,4% presentó recidivas y el 5,3% tuvo una lesión tendinosa en la extremidad contralateral. Sin embargo, no se han encontrado diferencias en la resolución de tendinopatías tratadas con MSCs por edad ni por sexo. Aunque los resultados de los primeros estudios sean favorables, hasta la fecha, la falta de estandarización de los protocolos y el número reducido de animales estudiados no permiten alcanzar conclusiones definitivas.
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    Es prematuro afirmar que el uso de células madre curará enfermedades como el alzheimer, el parkinson y la diabetes/Mariano Valdés: reseña bibliográfica
    (Murcia : Servicio de Publicaciones de la Universidad de Murcia, 2004) Ríos, Víctor R.
    El profesor Mariano Valdés, jefe del Servicio de Cardiología del Hospital Virgen de la Arrixaca de Murcia, relata su experiencia pionera en la implantación de células madre en el corazón de pacientes infartados y asegura que todavía no se han obtenido resultados determinantes.
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    Estudio de biocompatibilidad de dos composites de baja contracción sobre células madre de origen dental
    (2016-01-21) Martínez-Lage Azorín, Juan Francisco; Rodríguez Lozano, Francisco Javier; Serrano Belmonte, Ildefonso; Pérez Calvo, Juan Carlos; Departamento de Dermatología, Estomatología, Radiología y Medicina Física
    Objetivos: El objetivo de este estudio es analizar el comportamiento de dos composites de baja contracción, tipo bulkfill (SDR™ Dentsply, y Venus® Bulkfill, Heraeus Kulzer), en términos de citotoxicidad y biocompatibilidad al entrar en contacto con un cultivo de células madres de pulpa (DPSCs) y ligamento periodontal (PDLSCs). Material y métodos: Se obtuvieron cultivos celulares primarios de muestras de dientes extraídos por indicaciones clínicas. Tras la siembra de las células obtenidas en medios apropiados y tras el análisis de su fenotipo, se cultivaron en un medio con los composites del estudio y se analizaron en diferentes diluciones. Se realizó un ensayo de MTT y se midió la absorbancia a las 24, 48, 72 y 198 horas. Los resultados fueron analizados mediante observación a microscopio con técnicas de inmunocitofluorescencia y mediante la aplicación de métodos estadísticos. Para medir la viabilidad celular en presencia de las diferentes diluciones se usó el Test de Kruskal-Wallis. Para el estudio de apoptosis o muerte celular se usó el análisis de la chí-cuadrado. Resultados: Los composites estudiados por su composición, similar en muchos aspectos a la de otros composites derivados de polímeros de metacrilato, producen una respuesta citotóxica esperada. La respuesta celular ante este efecto es limitada en el tiempo, con mayor repercusión en las primeras 24 horas y se reduce de forma gradual a lo largo de la semana. El grado de apoptosis, o muerte celular, producido por estos compuestos es similar al del grupo control negativo, por lo que son considerados aptos para su uso odontológico. El fenotipo que presentan las DPSCs y PDLSCs no se ve modificado tras la exposición a los composites, ya que mantienen su condición de células madre de origen mesenquimal. Objectives: The aim of this study is to analyze the behavior of two low-shrinkage composites, bulkfill type (SDR ™ Dentsply, and Venus® Bulkfill, Heraeus Kulzer) in contact with a culture of stem cells pulp (DPSCs) and periodontal ligament (PDLSCs) in terms of cytotoxicity and biocompatibility. Methods: Primary cell cultures from samples of tooth extraction were obtained by clinical indications. After seeding of the cells obtained in suitable media and after analysis of their phenotype, they were cultured in medium containing composites of the study and were analyzed at different dilutions. MTT assay was performed and absorbance at 24, 48, 72 and 198 hours was measured. The results were analyzed by microscope observation with immunocytofluorescence techniques and by statistical methods. To measure cell viability in the presence of different dilutions the Kruskal-Wallis test was used. For the study of apoptosis or cell death chi-square analysis was used. Results: The composites studied for their composition, similar in many respects to other composites derived from polymethyl methacrylate, produce an expected cytotoxic response. The cellular response to this effect is limited in time, with the greatest impact in the first 24 hours that is gradually reduced during the ensuing week. The degree of apoptosis, or cell death, produced by these compounds is similar to that of the negative control group, so they may be considered suitable for clinical dental use. Mesenchymal phenotype presented by DPSCs and PDLSCs is not modified after exposure to composites, thus maintaining its status as mesenchymal stem cells.
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    Estudio del potencial neural de las células progenitoras del ligamento periodontal
    (2013-12-20) Ramírez Monreal, María del Carmen; Martínez Pérez, Salvador; Garrido García, Vicenta Cecilia; Bueno López, Carlos; Departamento de Anatomía Humana y Psicobiología
    PALABRAS CLAVE Células madre adultas, células madre neurales, ligamento periodontal, cresta neural, diferenciación neural, recambio celular, marcaje genético, cerebro adulto. RESUMEN Varios estudios previos sugieren que las células madre derivadas de la cresta neural pueden todavía existir en tejidos derivados de la misma, incluido el ligamento periodontal humano (hPDL). En este trabajo se estudia el potencial de diferenciación neural de las células derivadas del hPDL. In vitro, células derivadas del hPDL, bajo condiciones de proliferación, expresan marcadores de células madre mesenquimales, neurales y de la cresta neural. Tras su cultivo en medio inductor neural pueden proliferar formando neuroesferas, cambiando su morfología al cultivarlas con sustrato de adhesión y expresando marcadores de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. In vivo, los injertos celulares sobrevivieron al trasplante, se integraron, migraron y expresaron DCX, NF-M, GABA, GFAP y NG2 en el cerebro de ratón adulto. Las propiedades de diferenciación de las células derivadas hPDL en el cerebro de ratón adulto indica que son una fuente potencial de células madre neurales para su uso en medicina regenerativa. ABSTRACT Several previous studies have suggested that stem cells derived from the neural crest (NC) may still reside in NC-derivatives including the human periodontal ligament (hPDL). In this study we have examined the expression of NC-markers and the neural differentiation potential of hPDL-derived cells. In vitro we found that hPDL-derived cells expressed stem cell markers and a subset of NC cell markers. hPDL-derived cells were able to differentiate into neural-like cells based on cellular morphology and the expression of neural markers. In vivo, grafts of hPDL-derived cells survive transplantation, integrate, migrate and generate surviving human DCX+, NF-M+, GABA+, GFAP+ and NG2+ cells in the adult mouse brain. Some of the grafted hPDL-derived cells could be localized in stem cell niches. The differentiation properties of hPDL-derived cells in the adult brain indicate that hPDL-derived cells are a potential source of neural stem cells for use in regenerative medicine.
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    Estudio en fase I de utilización de las células madre de médula ósea autólogas en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica
    (2012-10-19) Blanquer Blanquer, Miguel; Moraleda Jiménez, José María; Martínez Pérez, Salvador; Gómez Espuch, Joaquín Antonio; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Medicina Interna
    Nuestro objetivo fue comprobar la seguridad de la infusión intraespinal de células mononucleadas de médula ósea autóloga (BMNCs) y buscar signos de neurotrofismo celular en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Realizamos un ensayo fase I, infundiendo BMNCs en el cordón posterior medular. La seguridad se definió como la ausencia de eventos adversos severos relacionados con el tratamiento. Incluimos once pacientes. No hubo eventos adversos severos relacionados con el tratamiento. Tampoco hubo aceleración del deterioro de la capacidad vital forzada ni de las escalas ALS-FRS, Norris o MRC. Cuatro pacientes fallecieron por razones no relacionadas con el tratamiento. Se observó un mayor número de motoneuronas/sección en los segmentos tratados que en los no tratados (4.2±0.8 y 0.9±0.3 respectivamente). Estas motoneuronas estaban rodeadas por células CD90+ y no presentaban depósitos degenerativos. Este estudio confirma la seguridad de la infusión intraespinal de BMNCs en ELA y proporciona evidencias de su actividad neurotrófica. Our aim was to assess the safety of intraspinal infusion of autologous bone marrow mononuclear cells (BMNCs) and to look for signs of cellular neurotrophism in amyotrophic lateral sclerosis patients (ALS). We conducted an open single arm phase I trial infusing BMNCs into the posterior spinal cord funiculus. Safety was defined as the absence of serious transplant-related adverse events. Eleven patients were included. There were no severe transplant-related adverse events. No acceleration in the rate of decline of forced vital capacity, ALS-FRS, Norris, or MRC scales was observed. Four patients died on days for reasons unrelated to the procedure. A greater number of motoneurons/section in the treated compared with the untreated segments (4.2±0.8 and 0.9±0.3 respectively) was observed. Those motoneurons were surrounded by CD90+ cells and did not show degenerative deposits. This study confirms the safety of intraspinal infusion of BMNC in ALS and provides evidence of their neurotrophic activity.
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    Estudio in vitro del efecto de las células madre mesenquimales de líquido amniótico sobre la función plaquetaria
    (Universidad de Murcia, 2018-11-19) Fernández-Arrausi García-Estañ, Marina; Marín Atucha, Noemí; Romecin Duran, Paola Alejandra; Escuela Internacional de Doctorado
    Introducción: Las células madre mesenquimales (CMM) obtenidas a partir de tejidos extraembrionarios, respresentan una nueva fuente de células madre para su uso en terapia celular. Están exentas de los problemas éticos y potencial tumorogénico asociados a las células madre embrionarias. Y respecto a las células madre adultas, presentan una mayor capacidad de proliferación y de diferenciación. Una de las fuentes de las CMM es el líquido amniótico, las cuales han demostrado tener excelentes propiedades inmunomoduladoras, antiinflamatorias, así como baja inmunogenicidad y teratogenicidad en transplantes in vivo. Recientemente, se han descrito efectos secundarios, principalmente fenómenos trombóticos cuando se administran las CMM por vía intravenosa. Estos efectos adversos se han relacionado con una mayor expresión del factor tisular, el cual activaría la vía extrínseca de la coagulación produciendo finalmente trombina. Se ha visto como las CMM interactúan con otras células, entre ellas las plaquetas, elementos con un papel fundamental en la hemostasia. Objetivos: El objetivo prinicpal es evaluar el efecto in vitro de las células madre mesenquimales de líquido amniótico (CMM-LA) sobre la función plaquetaria. Como objetivos secundarios nos planteamos el aislamiento, cultivo, caracterización de CMM-LA obtenidas de partos a término, analizar el efecto de las CMM-LA sobre la agregación y adhesión, evaluar el efecto de las CMM-LA sobre la expresión de marcadores de activación plaquetaria y el estudio del efecto de las CMM-LA sobre los niveles citoplasmáticos del calcio plaquetario. Material y métodos: las CMM se obtuvieron de líquidos amnióticos (LA) de cesáreas programadas de partos a término. Posteriormente se cultivaron en medio Amniomed, realizando un seguimiento del cultivo cada 48-72 horas. A los 30 días, se evaluó su capacidad de diferenciación a condrocitos, adipocitos y osteocitos, así como su identificación realizando la caracterización fenotípica. Así mismo se llevó a cabo el análisis molecular de las CMM-LA. En cuanto al análisis del efecto de las CMM-LA sobre la función plaquetaria se realizaron los ensayos clásicos de PFA-100 y Multiplate. Por citometría de flujo también se analizó el efecto de las CMM-LA sobre la agregación plaquetaria, sobre la expresión de marcadores de activación plaquetaria y sobre los niveles citoplasmáticos del calcio plaquetar. Resultados: Los cultivos de CMM-LA mostraron alta proliferación, capacidad de diferenciación y expresaron los maracadores mesenquimales CD105+, CD90+ y CD73+ y los factores de la coagulación y adhesión: factor VIII, factor de von Willebrand, factor tisular y podoplanina, siendo negativas para los marcadores hematopoyéticos CD45- y CD34-. En cuanto al estudio del efecto de las CMM-LA sobre la función plaquetaria, no se observaron diferencias por el analizador PFA-100. Por el contrario, el sistema Multiplate y el análisis por citometría de flujo sí mostraron cambios en la agregación y activación plaquetaria (expresión de P-selectina) tanto basalmente como en presencia de agonistas. Al evaluar el calcio plaquetario por citometría de flujo, observamos como la presencia de CMM-LA produce un ligero aumento de calcio citoplasmático en las plaquetas aisladas, mantenido solo en presencia de calcio extracelular, por el contrario las plaquetas que si interaccionan con las CMM-LA mostraron un progresivo y significativo aumento del calcio citoplasmático. Al realizar los mismos experimentos con heparina, cuya función es inhibir la producción de trombina, se observaron cambios significativos en la agregación, donde se observó una reducción de la respuesta, en la activación donde se disminuyó aún más la expresión de P-selectina, y en el aumento de calcio citoplasmático plaquetario de los agregados. Conclusiones: El líquido amniótio obtenido de partos a término es una fuente adecuada para la obtención de CMM. Las CMM-LA inducen cambios en la función plaquetaria, independientemente de sus efectos procoagulantes.
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    Estudio sobre la seguridad del constructo de células mesenquimales, fosfato tricálcico y matriz ósea desmineralizada para uso clínico
    (2015-03-25) Gonzálvez García, María del Mar; Rodríguez Lozano, Francisco Javier; Fernández-Villacañas Marín, Miguel Ángel; Facultad de Medicina
    Objetivo: Comprobar la seguridad y valorar la eficacia del uso del constructo formado por células mesenquimales de médula ósea humana (MSC) sembradas y cultivadas sobre matriz po-rosa de fosfato tricálcico (FTC) asociadas a matriz ósea desmineralizada (MOD) implantada en en ratones inmunodeprimidos NOD/SCID. Objetivos específicos: Estudiar la toxicidad aguda y crónica del implante (FTC+MSC+MOD) en modelo murino NOD/SCID. Estudiar la biodistribución del constructo (FTC+MSC+MOD) implantado en modelo murino NOD/SCID. Valorar si hay formación de tejido óseo en el lugar del implante en el ratón NOD/SCID del constructo (FTC+MSC+MOD). Valorar a partir de que momento se observa formación ósea en el lugar del implante en el ratón NOD/SCID del constructo (FTC+MSC+MOD). Metodología: Estudio prospectivo analítico con 30 ratones NOD/SCID divididos en 2 grupos de ensayo. El grupo experimental, de 25 ratones, se implanta subcutánea e intramuscularmente un constructo formado por células madre mesenquimales humanas sembradas en fosfato tricálcico mezcladas con matriz ósea desmineralizada (MSC+FTC+MOD). En el segundo grupo, control, de 5 ratones se implanta de forma análoga el constructo formado por suero salino fisiológico al 0,9%, fosfato tricálcico y matriz ósea desmineralizada (SSF 0,9%+FTC+MOD). Los ratones del primer grupo fueron sacrificados por parejas de macho y hembra a las 24h, a las 48h, a la semana, a las 2, 5, 7 y 9 semanas tras la cirugía. Los ratones del se-gundo grupo y los 11 ratones restantes del primer grupo se sacrificaron a las 12 semanas. Se ha evaluado la toxicidad aguda, a las 24 y 48 horas tras la cirugía, mediante el control del peso, el índice de bienestar animal, análisis sanguíneo, bioquímico y estudios histológicos de los órganos: hígado, pulmón, bazo, cerebro, riñón, corazón, gónadas, médula ósea y hueso. La toxicidad crónica fue evaluada mediante los mismos estudios que en fase aguda sacrificando 2 ratones en la 1ª, 2ª, 5ª, 7ª, 9ª semana, once ratones en la 12ª semana y los 5 ratones del 2º grupo. Para evaluar la biodistribución del constructo se realizó análisis PCR-RT de 2 proteínas, la Actina y la β2microglobulina a hígado, pulmón, bazo, cerebro, riñón, corazón, gónadas, médula ósea y de la sangre periférica de cada ratón sacrificado. Para valorar la eficacia se realizaron estudios histológicos del constructo implantado con hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson y estudios inmunohistoquímicos cualitativos y cuantitativos con anticuerpos anti-osteocalcina. Resultados o Conclusiones El implante subcutáneo o intramuscular del constructo FTC+MSC+MOD no ha mostrado signos de toxicidad aguda o crónica en el modelo murino NOD/SCID. Tras la implantación del constructo FTC+MSC+MOD implantado de forma subcutánea o intramuscular en el modelo murino NOD/SCID no han sido halladas células mesenquima-les humanas en ningún órgano. Permaneciendo las células en el lugar del implante. No se han observado diferencias estadísticamente significativas entre el poder osteogéni-co del constructo FTC+MSC+MOD. Aunque si existen entre el poder osteogénico del im-plante subcutáneo e intramuscular. La formación de tejido óseo estructurado se ha observado a partir de la semana 7 en la zona de implante subcutánea y a partir de la semana 9 en la zona de implante intramus-cular. “Safety of the construct of mesenchymal cells, tricalcium phosphate and bone matrix de-mineralized for clinical use.” SUMMARY (Objectives and methodology): Objectives To check the security and assess the effectiveness, of the use of mesenchymal cells of human bone marrow (MSC) seeded and cultured on tricalcium phosphate porous matrix (FTC) associated with demineralized bone matrix (MOD) implanted in immunosuppressed mice NOD/SCID. Specific objectives: To study the acute and chronic toxicity of the implant (FTC+MSC+MOD) construct in muri-ne NOD/SCID model. To study the biodistribution of the implant (FTC+MSC+MOD) construct in murine NOD/SCID model. To evaluate the formation of bone tissue at the site of the (FTC+MSC+MOD) construct im-plant. To evaluate the cronology of bone tissue formation at the site of the (FTC+MSC+MOD) construct implant. Methodology Analytical prospective study with 30 NOD/SCID mice divided into 2 treatment groups was performed. In the first group of 25 mice, a construct of mesenchymal stem cells seeded and cultured on tricalcium phosphate porous matrix and associated with demineralized bone matrix (MSC+FTC+MOD) was implanted subcutaneously and intramuscularly In the second group of 5 mice, a construction of 0,9% saline, matrix porous tricalcium phosphate associated with demineralized bone matrix (SSF0,9%+FTC+MOD) was im-planted also subcutaneously and intramuscularly Male and female mice pairs of the first group were - sacrificed at 24 h, 48 h, 1 week and then 2,5,7 and 9 weeks after surgery. The second group of mice and the 11 remaining mice of the first group were sacrificed at 12 weeks. Acute toxicity was evaluated by the assessment of - weight, the animal welfare score, blood and biochemical analysis and histological studies of organs: liver, lung, spleen, brain, kidney, heart, gonads, bone marrow and bone of each mouse sacrificed in the first 48h after surgery. Chronic toxicity was evaluated by the same studies sacrificing 2 mice in the 1st, 2nd, 5th, 7th and 9th week, eleven mice in the 12 th week, and the remaining 5 of the second group. Biodistribution of the construct was analysed by RT-PCR test of 2 proteins, actin and the β2microglobulin of liver, lung, spleen, brain, kidney, heart, gonads, bone marrow and pe-ripheral blood from each mouse sacrificed. Effectiveness was evaluated at implanted site by qualitative and quantitative studies Im-munohistochemistry with anti-osteocalcin antibodies and histological studies with hema-toxylin-eosin, Masson's trichrome were performed. Conclusions Construct (FTC+MSC+MOD) implanted via subcutaneous or intramuscular has not pre-sented any signs of acute or chronic toxicity in the mouse model NOD / SCID. Human mesenchymal stem cells have not been found in any organ analyzed at murine model of Construct (FTC+MSC+MOD) implanted subcutaneously or intramuscularly . These have remained at the implant site. No statistically significant differences were observed between the osteogenic power of the construct MSC + FTC + MOD. However, it has definetely been found between subcutane-ous and intramuscular implant. Structured bone formation is observed from week 7 in the subcutaneous implant and from week 9 in the intramuscular implant.