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Análisis del aire exhalado "off-line" para la búsqueda de biomarcadores de enfermedades respiratorias en la clínica pediátrica
(Universidad de Murcia, 2022-07-11) Sola Martínez, Rosa Alba; Cánovas Díaz, Manuel; Diego Puente, Teresa de; Escuela Internacional de Doctorado
En el aire exhalado humano es posible distinguir una gran variedad de compuestos orgánicos volátiles (VOCs). Sin embargo, el conjunto de VOCs, “volatiloma”, presentes en el aire exhalado y su concentración en cada individuo pueden depender de diversos factores, como diferencias en el metabolismo, presencia de patologías o exposición a contaminantes ambientales, entre otros. Por todo ello, en los últimos años, el aire exhalado humano ha sido considerado una fuente prometedora de biomarcadores para el diagnóstico y la monitorización de numerosas patologías como enfermedades respiratorias de alta prevalencia. Asimismo, también se ha sugerido que el análisis del aire exhalado podría ser útil para controlar las exposiciones a contaminantes ambientales y para el seguimiento del estrés oxidativo. Una de las principales ventajas de este enfoque, es que se trata de una metodología no invasiva. La estrategia más extendida para la determinación de VOCs en el aliento humano es el análisis del aire exhalado fuera de línea u off-line mediante tecnologías basadas en espectrometría de masas. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral ha sido aplicar y avanzar en el desarrollo del análisis del aire exhalado off-line para la búsqueda de biomarcadores de enfermedades respiratorias y/o atópicas en población pediátrica y en mujeres en edad fértil. Gran parte de la presente Tesis Doctoral se enmarca dentro del estudio NELA (Nutrition in Early Life and Asthma) que ha reclutado una cohorte de 738 parejas madre/hijo de la Región de Murcia desde la semana 20 de embarazo, con la finalidad de esclarecer el origen del asma durante la infancia y determinar qué factores influyen en su desarrollo. Así, en esta tesis se ha recogido y analizado las muestras de aire exhalado de las parejas de madres e hijos de la cohorte NELA a los 3 meses de edad del niño. En el Capítulo 3, se ha realizado una revisión sistemática de los estudios previos donde se ha aplicado el análisis del aire exhalado en población pediátrica. En el Capítulo 4, se expone el desarrollo de un flujo de trabajo de código abierto para el preprocesamiento de datos brutos obtenidos mediante espectrometría de masas. Además, en este capítulo se muestra un protocolo de recogida de aire exhalado para adultos y niños de corta edad, y un protocolo de análisis del aire exhalado off-line mediante TD-GC/q-MS (desorción térmica acoplada a cromatografía de gases-espectrometría de masas de cuadrupolo simple). En el Capítulo 5, se han identificado perfiles de VOCs en el aire exhalado de mujeres en edad fértil que permiten discriminar entre asmáticas con otras enfermedades atópicas coexistentes y no asmáticas. Asimismo, también se evaluó el impacto de la época del año cuando se realizaron las determinaciones de VOCs, sobre el proceso de descubrimiento de biomarcadores de enfermedades mediante el análisis del aire exhalado off-line, y se desarrollaron estrategias para afrontar los posibles sesgos introducidos. En el Capítulo 6, se estudió la relación entre los VOCs exhalados y la función pulmonar en lactantes sanos. En el Capítulo 7, se determinó la influencia de la exposición a la humedad en los hogares sobre los VOCs en el aire exhalado. Por último, en el Capítulo 8, se evaluó el efecto del almacenamiento de muestras de aire exhalado antes de su análisis mediante sistemas analíticos on-line, concretamente SESI-HRMS (ionización secundaria por electrospray-espectrometría de masas de alta resolución). En base a los resultados obtenidos, las principales conclusiones que se pueden extraer de la presente Tesis Doctoral son: 1) La introducción de las prácticas típicas del campo de la metabolómica es fundamental para alcanzar la traslación clínica del análisis del aire exhalado; 2) Se ha diseñado un protocolo para la recogida y análisis de muestras de aire exhalado mediante TD-GC/q-MS adecuado para población adulta y pediátrica; 3) Se ha desarrollado un flujo de trabajo de código abierto para el preprocesamiento de datos obtenidos en el análisis del aire exhalado off-line mediante TD-GC/q-MS; 4) El análisis del aire exhalado off-line mediante TD-GC/q-MS en mujeres en edad fértil permite diferenciar entre asmáticas con otras enfermedades atópicas coexistentes y no asmáticas (con o sin enfermedades atópicas); 5) Se ha caracterizado la varianza causada por los factores experimentales por implementación de ASCA, que combina el análisis de varianza (ANOVA) y el análisis de componentes simultáneos y se ha solventado el sesgo causado por la estación del año en la que se recolectaban las muestras de aliento; 6) Existe una asociación entre los VOCs exhalados y la función pulmonar en lactantes sanos; 7) La exposición prolongada a humedad en el hogar puede influir en el volatiloma exhalado, concretamente en los niveles del contaminante 2-etil-1-hexanol en mujeres en edad fértil y 8) Las muestras de aire exhalado pueden ser almacenadas durante horas en bolsas de muestreo de gas sin una pérdida determinante de intensidad de los compuestos, y posteriormente ser analizadas mediante SESI-HRMS.
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Análisis genómico y transcriptómico de caracteres ligados a la calidad del fruto en Albaricoquero
(Universidad de Murcia, 2020-02-06) García Gómez, Beatriz Ester; Martínez-Gómez, Pedro; Ruiz González, David; Escuela Internacional de Doctorado
El albaricoquero (Prunus armeniaca L.) es uno de los cultivos con mayor valor agronómico a nivel mundial, destacando su fruto por su calidad gustativa muy apreciada por el consumidor y como un alimento funcional con propiedades nutricionales y bioactivas, notablemente beneficioso para la salud humana. La adquisición de los caracteres de calidad tiene lugar durante la fase final de maduración del fruto, el cual es un proceso coordinado en el que se produce un cambio en la expresión de cientos a miles de genes, modificando numerosos procesos bioquímicos y fisiológicos que darán lugar a los rasgos característicos de calidad del fruto. En este contexto, la mejora de la calidad del fruto es uno de los objetivos prioritarios a conseguir en las nuevas variedades desarrolladas por los programas de mejora genética del albaricoquero. El objetivo de esta Tesis Doctoral es avanzar en el análisis genómico y transcriptómico de los mecanismos moleculares implicados en la expresión de caracteres asociados a calidad del fruto en albaricoquero a fin de identificar y validar genes candidatos ligados a la expresión de caracteres de calidad para posibilitar el desarrollo de marcadores moleculares específicos, aplicables a la selección asistida en los programas de mejora de la especie. Desde el punto de vista genómico, dos poblaciones segregantes fueron fenotipadas y genotipadas. Se saturó con nuevos marcadores de ADN los Grupos de Ligamiento (GLs) 3 y 4, donde trabajos anteriores habían localizado Quantitative Trait Loci (QTL) para caracteres ligados a calidad del fruto, permitiendo la identificación de QTLs significativos vinculados a rasgos fenológicos y de calidad del albaricoque, la identificación de genes candidatos y la validación biológica de estos QTL a través del análisis de expresión génica mediante el uso de qRT-PCR. En el análisis QTL, los resultados más relevantes muestran QTLs muy significativos ligados al color de la piel del fruto en GL3 y a la fecha de maduración en GL4. Es destacable la co-localización NAC cerca del QTL de fecha de maduración en el GL4; y un gen que codifica un factor de transcripción MYB10 cerca del QTL de color de la piel en el GL3. El análisis de ambos genes mediante el uso de qRT-PCR valida estos análisis QTLs. En una segunda etapa, los transcriptomas de dos genotipos de albaricoque de la misma población segregante F1 con características fenotípicas divergentes fueron secuenciados (RNA-Seq) en tres etapas de desarrollo durante la maduración del fruto. Varios genes son propuestos como genes candidatos implicados en las rutas de biosíntesis de fenilpropanoides, flavonoides, antocianinas y carotenoides; el metabolismo del almidón y la sacarosa; los transportadores de metabolitos secundarios; la degradación de la pared celular y la pérdida de firmeza; el metabolismo del etileno; la degradación de las clorofilas; y los factores de transcripción y los reguladores del crecimiento que intervienen en la regulación del proceso de maduración. De este análisis, los genes candidatos DIOXIGENASA DE CAROTENOIDES 4 y una SACAROSA SINTASA han sido validados como genes clave en el color amarillo claro/blanco del fruto y el alto contenido de sólidos solubles. Finalmente, fue analizada la dinámica de expresión de los genes candidatos obtenidos a partir de los resultados de QTLs y RNA-Seq fue analizada durante el proceso de maduración del fruto en nueve variedades de referencia de albaricoquero que reúnen una gran variabilidad en el color de piel y pulpa, fecha de maduración, acidez y firmeza del fruto. La construcción de modelos de regresión lineal múltiple (MLR) para el contenido de antocianinas y carotenoides permitió la evaluación de los genes que tenian una mayor influencia dentro del modelo, siendo estos genes candidatos clave durante la biosíntesis de los metabolitos estudiados o la regulación del proceso de maduración. Como resultado, se ha obtenido un modelo con un alto porcentaje de explicación y ajuste adecuado para la biosíntesis de carotenoides. Los genes CHALCONA SINTASA y 4-CUMARATO-COA LIGASA, implicados en la biosíntesis de antocianinas, se describen como genes clave en el contenido de antocianinas; mientras que la DIOXIGENASA DE CAROTENOIDES 4, responsable de la degradación de los carotenoides y cuya expresión está ligada al color amarillo claro del fruto, junto con la ZETA-CAROTENO DESATURASA, se validan como genes clave para el contenido de carotenoides y el color del fruto. En relación con el proceso de maduración, la LIPOXIGENASA 2 y el factor de transcripción MADS-BOX se proponen como genes candidatos para el seguimiento de la progresión del proceso de maduración en el albaricoque. A partir de los resultados obtenidos en este análisis genómico-transcriptómico integrado, el siguiente paso será identificar polimorfismos genéticos en estos genes candidatos vinculados a polimorfismos fenotípicos, con el fin de desarrollar marcadores de ADN específicos para su uso en la selección asistida por marcadores moleculares (marker-assisted selection, MAS), y así aumentar la eficiencia de los programas de mejora de albaricoquero mediante la selección precoz de genotipos con alta calidad del fruto.
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Bases genéticas y moleculares de la época de floración en almendro
(Universidad de Murcia, 2019-11-21) Sánchez Prudencio, Ángela; Martínez-Gómez, Pedro; Dicenta López-Higuera, Federico; Escuela Internacional de Doctorado
Los frutales de clima templado, como el almendro, han desarrollado un mecanismo para asegurar su supervivencia durante el invierno. Este mecanismo es conocido como letargo y se caracteriza por la ausencia de crecimiento activo visible en el árbol. En esta fase, las yemas vegetativas y florales se encuentran protegidas de posibles daños debidos a las bajas temperaturas. La salida del letargo es un carácter dependiente del genotipo y requiere que se satisfagan unas determinadas necesidades de frío que, junto con la posterior acumulación de calor, determinará la época de floración de cada variedad. Cuanto mayores sean las necesidades de frío, más tardía será la floración. Retrasar la época de floración ha sido uno de los principales objetivos en los programas de mejora del almendro y las variedades tardías obtenidas han hecho posible la extensión del cultivo a zonas muy frías, nunca antes consideradas para la producción de almendra. El objetivo de la presente Tesis Doctoral ha sido el análisis de las bases genéticas y moleculares de la salida del letargo y la época de floración en almendro, para identificar marcadores moleculares asociados a estos caracteres agronómicos. La evaluación de la acumulación de frío para la salida del letargo mediante diferentes modelos y la evaluación de la acumulación de calor para florecer en variedades de almendro en condiciones naturales, mostró una mayor precisión del Modelo Dinámico, sobre el Modelo Richardson, sobre todo en los inviernos cálidos. La acumulación de calor para florecer fue mayor en todas las variedades de estudio cuando la acumulación de frío fue menor. Así mismo, se observó una disminución en la productividad de las variedades tardías cuando la acumulación de frío durante el invierno fue insuficiente. El control de la temperatura durante el letargo permitió retrasar la floración de la variedad extra-temprana, y de adelantar su época de maduración. El retraso en la floración de los diferentes tratamientos supuso un retraso proporcional de la época de maduración. En el caso de la variedad ultra-tardía no se consiguió avanzar sustancialmente la floración. El escalonamiento de la floración no tuvo un efecto directo sobre el cuajado y las características del fruto estudiadas. El estudio de genes candidatos asociados a la salida del letargo y la época de floración permitió la caracterización del gen de la peroxidasa 40 (PdP40) como marcador potencial de la salida del letargo. Mediante la secuenciación masiva del transcriptoma (RNA-seq), se han identificado nuevos genes candidatos y otros cuya expresión está asociada a genotipos de almendro tempranos y tardíos. Por último, los resultados del análisis de metilación diferencial de ADN de yemas de flor en distintos estados de letargo, permitió la identificación de genes diferencialmente metilados en yemas de flor en estado de letargo, respecto a yemas activas y genes diferencialmente metilados en yemas del almendro extra-temprano respecto a las del ultra-tardío. Temperate fruit tree species, like almond, have developed a mechanism known as dormancy that ensures their survival during winter. This mechanism is characterized by the absence of visible active growth in the tree. In this phase, vegetative and flower buds are protected from injuries caused by low temperatures. Dormancy release is a genotype-associated character that requires a specific chill accumulation, what followed by heat accumulation determines the flowering time of each cultivar. The higher are the chilling requirements the latest is the flowering time. The delay of flowering time has been one of the main objectives in breeding programs, and late flowering cultivars released make possible the spread of the culture to cold areas, never considered before for almond production. The objective of this Thesis was the analysis of genetic and molecular basis of dormancy release and flowering time in almond, for the identification of molecular markers associated to these agronomical traits. Evaluation of chill accumulation for dormancy release by different models and heat accumulation for flowering, in almond cultivars under natural conditions, showed that for chill accumulation the Dynamic Model was more accurate than Richardson Model, especially during mild winters. Heat accumulation for flowering was higher in all the cultivars studied when chill accumulation was lower. Moreover, a decrease in the productivity of late flowering cultivars was observed when chill accumulation was insufficient. Temperature control during dormancy allowed the delay of flowering time in the extra-early cultivar studied. The delay of flowering time of different treatments led to a proportional delay in the ripening time. However, flowering time could not be substantially advanced with the ultra-late cultivar. Flowering time shift did not affect the fruit set and fruit characteristics studied. The analysis of candidate genes associated to dormancy release and flowering time allowed the identification of the peroxidase 40 gene (PdP40) as a potential marker of dormancy release. By the transcriptome sequencing (RNA-seq) of flower buds during dormancy release new candidate genes associated to dormancy phases and other genes that exhibited early and late cultivar-associated expression patterns were identified. Finally, DNA methylation analysis of flower buds in different dormancy phases allowed the identification of differentially methylated genes in dormant buds versus non-dormant buds and differentially methylated genes in the studied early cultivar flower buds compared to the late cultivar flower buds.
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Biochemical and metabolomic characterisation of fruits from grafted tomato ( Solanum Lycopersicum L.) plants under selection by insect pollinators under abiotic stress conditions
(Universidad de Murcia, 2026-06-23) Ormazabal Oria, Maialen; Martínez Andújar, Cristina; Sánchez Prudencio, Ángela; Albacete Moreno, Alfonso Antonio; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
El tomate (Solanum lycopersicum L.) es uno de los cultivos hortícolas más importantes a escala mundial; sin embargo, su producción está cada vez más limitada por estreses abióticos asociados al cambio climático, especialmente la salinidad y la reducción en la disponibilidad de agua y nutrientes. Estas condiciones afectan negativamente al rendimiento y a la calidad del fruto, alteran procesos fisiológicos esenciales, como la fotosíntesis, la absorción de nutrientes y el equilibrio hormonal, y pueden comprometer servicios ecosistémicos clave, entre ellos la interacción planta-polinizador. Dado el papel fundamental de los polinizadores en la mejora del cuajado, tamaño y calidad del fruto, comprender cómo el estrés y el genotipo vegetal modulan estas interacciones resulta esencial para la sostenibilidad productiva.La presente tesis doctoral evaluó si el genotipo del portainjerto y las condiciones de estrés abiótico influyen en el desempeño fisiológico, la productividad, la composición metabólica del fruto y el comportamiento de forrajeo de abejorros. La variedad comercial 'Unidarkwin F1' se injertó sobre distintos portainjertos experimentales y se cultivó en invernadero bajo tres regímenes de riego: óptimo (control), estrés salino (75 mM NaCl) y baja fertigación (50 % del suministro óptimo). Durante la floración se introdujeron colonias de Bombus terrestris y la actividad de los polinizadores se monitorizó mediante un sistema RFID, cuantificando el número de visitas, el tiempo total de visita y el número de individuos activos. A lo largo del ciclo del cultivo se evaluaron parámetros fisiológicos y agronómicos, así como características bioquímicas de hojas, flores y frutos. Los perfiles metabolómicos se determinaron mediante HPLC-MS y GC-MS, y la composición mineral mediante ICP-OES.Los resultados evidenciaron que el heteroinjerto mejora el rendimiento agronómico y el estado fisiológico bajo condiciones de estrés, favoreciendo la translocación de agua y nutrientes hacia la parte aérea. En condiciones de salinidad, el portainjerto silvestre S. pimpinellifolium destacó por su mayor vigor, estabilidad fisiológica y rendimiento. Bajo baja fertigación, los híbridos 76xM82 y 76xPimpi mostraron mayor biomasa y producción, junto con respuestas fisiológicas más eficientes frente a la limitación de recursos. Asimismo, el heteroinjerto modificó la composición del fruto: bajo salinidad se incrementaron los ácidos orgánicos, determinados nutrientes y fitohormonas, mientras que en baja fertigación mejoraron atributos de calidad como color, firmeza y sólidos solubles en comparación con el autoinjerto.El comportamiento de forrajeo de los polinizadores estuvo condicionado tanto por el genotipo del portainjerto como por el tipo de estrés. En salinidad, S. pimpinellifolium fue consistentemente el genotipo más preferido, en concordancia con su mayor productividad. En baja fertigación, los híbridos 66xPimpi y Tl01749xM82 registraron mayor actividad de visita, asociada principalmente a un mayor rendimiento fotosintético más que al rendimiento final de fruto. La actividad de forrajeo se relacionó con cambios en la composición metabólica del fruto, incluyendo variaciones en fitohormonas, ácidos orgánicos (malato y fumarato), tirosina y perfiles minerales. Estudios preliminares sugieren además que compuestos como galactinol y treonato podrían actuar como señales energéticas en flores bajo salinidad, y que el contenido foliar de carbono se asocia positivamente con la preferencia de los polinizadores.En conjunto, los resultados demuestran que el uso de portainjertos genéticamente diversos incrementa la resiliencia del tomate frente a salinidad y limitación nutricional, al mejorar la eficiencia fisiológica, la estabilidad productiva y la calidad metabolómica del fruto. Estas respuestas, dependientes del genotipo y del estrés, también modulan la interacción con los polinizadores. El injerto se confirma así como una estrategia eficaz para sostener la productividad y calidad del cultivo en escenarios de cambio climático, integrando dimensiones agronómicas y ecológicas.
Embargo
Caracterización de los mecanismos moleculares de translocación de K+ y nuevos reguladores del transportador SlHAK5 en Solanum lycopersicum L
(Universidad de Murcia, 2025-12-01) Martínez Martínez, Almudena; Nieves Cordones, Manuel; Rubio Muñoz, Francisco; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
Objectives K+ is an essential macronutrient for plants, involved in numerous physiological processes. In the current context, where it is necessary to develop varieties with improved nutrient uptake and use efficiency to address agronomic and environmental challenges, understanding the molecular mechanisms regulating K+ uptake and translocation is of particular relevance. Therefore, this doctoral thesis pursued three main objectives: (1) to study the role of the kinase SlCIPK9 in the regulation of the SlHAK5 transporter in tomato; (2) to analyze the function of the SlNRT1.5 transporter in K+ translocation from root to shoot; and (3) to identify new SlCIPK/SlCBL complexes involved in the activation of the SlHAK5 transporter. Methodology The above objectives were addressed through a combination of approaches, including heterologous expression assays in yeast and Xenopus laevis oocytes, bifluorescence assays to study protein–protein interactions, generation of knockout plants using CRISPR-Cas, hydroponic cultivation of tomato plants, determination of cation and anion content, pollen germination and tube elongation studies, as well as microscopy techniques. Conclusions The experimental work led to the following conclusions:1. slcipk9 mutant plants do not exhibit impaired K+ uptake or growth under low-K+ conditions, suggesting a limited role of SlCIPK9 in K+ nutrition in tomato. 2. SlCIPK9 is predominantly expressed in stamens, and its loss of function led to significantly shorter pollen tubes, revealing a specific role in pollen tube elongation. 3. The pollen phenotype observed in slcipk9 mutants occurs despite normal K+ content, indicating that SlCIPK9 regulates pollen tube elongation via a K+-independent mechanism. 4. SlNRT1.5 mediates K+ efflux when is expressed in Xenopus oocytes and, in tomato plants, it is expressed in multiple tissues, with particularly high expression in the root stele. 5. slnrt1.5 plants accumulate less K+ shoots than WT plants under low external pH (4.5) and limited K+ (0.05 mM) and N (0.5 mM) supply, indicating that SlNRT1.5 is a central component of K+ translocation, most likely by mediating K+ loading into the xylem vessels. 6. Further analyses of slskor slnrt1.5 double mutants reveal an overlapping role of SlSKOR and SlNRT1.5 to shoot K+ accumulation, with SlNRT1.5 playing a more prominent role under low-K+ conditions. 7. The targeted yeast complementation assay identify SlCIPK15 and SlCIPK26 as novel kinases capable of activating the high-affinity K+ transporter SlHAK5. Their functionality was confirmed through Rb+ uptake assays in yeast and BiFC interaction studies in Nicotiana. 8. Studies with slcipk15 knockout plants shows that this kinase plays an important role in pollen tube elongation but not in pollen germination. Unexpectedly, SlCIPK15 acts as a negative regulator of K+ translocation rather than as a positive regulator of SlHAK5-mediated K+ uptake. 9. Functional characterization of slcipk26 knockout lines reveals impaired pollen germination and phenotypes resembling those of slhak5 mutants, suggesting that SlCIPK26 regulates SlHAK5 in reproductive tissues. In contrast, in roots SlCIPK26 does not appear to play a major role in SlHAK5-mediated K+ transport.
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Cultivo de la trufa del desierto : nuevas perspectivas sobre la simbiosis micorrícica, estrategias de adaptación al estrés hídrico y manejo de plantaciones
(Universidad de Murcia, 2020-01-16) Marqués Gálvez, José Eduardo; Morte Gómez, María Asunción; Pérez Gilabert, Manuela; Escuela Internacional de Doctorado
Las trufas del desierto son hongos micorrícicos que desarrollan cuerpos fructíferos hipogeos y cuyo hábitat se limita a zonas áridas y semiáridas, principalmente de la cuenca del Mediterráneo y de Oriente Medio. De entre las trufas del desierto destacan los géneros Terfezia y Tirmania, cuyas especies forman ectendomicorrizas con plantas del género Helianthemum. La especie Terfezia claveryi Chatin fue la primera trufa del desierto en ser cultivada junto con la planta hospedante Helianthemum almeriense Pau. La presente tesis tiene el objetivo de aumentar nuestro conocimiento acerca de las trufas del desierto. Para cumplir este objetivo se propusieron cinco objetivos parciales cuyo desarrollo ha dado lugar a diversos resultados y conclusiones. Para evaluar el papel de catalasas fúngicas en la simbiosis T. claveryi y H. almeriense, se purificó una catalasa TcCAT-1 de ascocarpo de T. claveryi que fue caracterizada mediante técnicas bioquímicas, cromatográficas y bioinformáticas. Además, se midieron los niveles de transcripción del gen TcCAT-1 mediante PCR cuantitativa. Los resultados sugieren que TcCAT-1 puede jugar un papel importante durante la micorrización; además, este estudio ha puesto de manifiesto los beneficios de esta micorrización en la respuesta al estrés hídrico. Por otra parte, se secuenciaron los genomas de T. claveryi y Tirmania nivea y el transcriptoma de T. claveryi en micelio libre, micorriza bien regada y micorriza sometida a estrés hídrico; posteriormente se llevó a cabo el análisis bioinformático de todos esos datos. Se han descrito por primera vez los genes MAT de estas especies. También se estudió el patrón de expresión de las enzimas que actúan sobre la pared celular vegetal; este estudio ha revelado una regulación a la baja de estos genes durante la sequía, al mismo tiempo que se producía un cambio de tipo de micorrización, pasando de intercelular a intracelular. En general, las características descritas en este apartado están asociadas al tipo de micorriza formada por estas especies y a su adaptación a los hábitats secos. También se realizó un estudio de los datos que se han ido recogiendo durante 15 años de una plantación experimental de T. claveryi x H. almeriense con el objetivo de determinar los parámetros que más influyen en las fructificaciones de trufas del desierto y en qué momentos del año tienen una importancia mayor. Tras el análisis estadístico de los datos se puso de manifiesto que el índice de aridez en otoño y el potencial hídrico del suelo desde otoño a primavera, parecen ser los parámetros claves. Estos resultados nos han permitido proponer distintos modelos de manejo de plantaciones. En otro de los capítulos de esta tesis se caracterizaron las respuestas morfo-fisio-moleculares de la planta micorrizada H. almeriense durante primavera. Medidas de intercambio gaseoso y de cuantificación de la expresión de determinados genes de acuaporinas, pusieron de manifiesto un cambio brusco en la fenología de la planta que parece estar determinado, mayoritariamente, por el déficit de presión de vapor (DPV). Gracias a este resultado se ha determinado un valor umbral de DPV que está relacionado con la producción de trufas del desierto, y podemos concluir que, en líneas generales, cuanto más tarde se alcance este umbral en la primavera, mayores serán las producciones. Finalmente, con el fin de estudiar la viabilidad de este cultivo si se produjese un aumento en concentración de CO2 atmosférico, se realizó un ensayo en el que sometió a un grupo de H. almeriense micorrizadas con T. claveryi a una elevada concentración de CO2 combinado con un progresivo aumento de la sequía. Los resultados de este ensayo revelan que los efectos de una concentración elevada de CO2 pueden paliar, en parte, los efectos negativos del aumento de la sequía. Summary Desert truffles are mycorrhizal fungi that develop hypogeus fruiting bodies and inhabit arid and semiarid areas, such as the Mediterranean basin or the Middle East. Among desert truffles genera, Terfezia and Tirmania are of special importance. The species that belong to these genera mostly establish ectendomycorrhizal symbiosis with plants of Helianthemum genus. Terfezia claveryi Chatin was the first desert truffle cultivated, using Helianthemum almeriense Pau as its host. This thesis has the objective of deepen the knowledge of desert truffles and their cultivation. To achieve this goal, five specific objectives were proposed that have resulted in several results and conclusions. In order to evaluate the role of fungal catalases in T. claveryi x H. almeriense symbiosis, a catalase, TcCAT-1, from T. claveryi ascocarps was purified to homogeneity and characterized using biochemical, chromatographic and bioinformatic techniques. In addition, transcription levels of the gene TcCAT-1 were measured by quantitative PCR. The results obtained suggest an important role of TcCAT-1 in the mycorrhization; in addition, this study has revealed the benefits of this mycorrhization in the response to water-stress. The genomes of T. claveryi and Tirmania nivea and the T. claveryi transcriptome from free living mycelium, well-watered mycorrhiza and drought-stressed mycorrhiza were sequenced and analyzed with bioinformatics tools. MAT genes have been described in these species for the first time. Furthermore, the expression pattern of plant cell wall degrading enzymes revealed a generalized downregulation of these genes under water-stress conditions. This event occurs in parallel with the type of mycorrhiza that is formed, which changes from intercellular to intracellular. In summary, the genomic and transcriptomic features described in this thesis are associated with the type of mycorrhiza and the dry environments inhabited by these species. During this thesis, data collected during 15 years of an experimental orchard of T. claveryi x H. almeriense were analyzed in order to know what environmental parameters and at what times of the year determine the production of desert truffle the most. After the statistical analysis of the data, we found that autumn first, and spring, secondly, are the key moments that determine T. claveryi yield. Specifically, the aridity index in autumn and the soil water potential from autumn to spring are the most important parameters. With this in mind, several management models are proposed. The morpho-physio-molecular responses of the H. almeriense mycorrhizal plant were characterized during spring. Using gas-exchange and molecular techniques, an abrupt phenology switch was revealed. This switch seems to be determined primarily by the vapor pressure deficit (VPD). Thanks to this, a threshold value of VPD has been established that is related to the desert truffle fructifications: in general terms, the later this threshold is reached, the higher the desert truffle yield. In order to evaluate the viability of this crop under the foreseeable increase in atmospheric CO2 concentrations in the following years, an assay was carried out. This assay consisted of growing a group of T. claveryi mycorrhizal H. almeriense plants under high concentrations of atmospheric CO2, combined with a progressive increase in water-stress conditions. The results of this assay reveal that the effects of a high atmospheric concentration of CO2 partially counteract the negative effects derived from water-stress.
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Edición de genes de tomate que codifican potenciales factores provirales para el virus del mosaico del pepino dulce
(Universidad de Murcia, 2020-12-03) Rodríguez Sepúlveda, Pascual; Aranda Regules, Miguel Ángel; Donaire Segarra, Livia; Hernando Saiz, Yolanda; Escuela Internacional de Doctorado
El virus del mosaico del pepino dulce (PepMV; especie Pepino mosaic virus, género Potexvirus; familia Alphaflexiviridae) es un virus de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva que causa una de las principales enfermedades que afectan a los cultivos de tomate de todo el mundo, provocando importantes pérdidas económicas. En la actualidad, no se dispone de variedades de tomate comerciales resistentes a PepMV y las fuentes de resistencia descritas son poco apropiadas para su uso en programas de mejora. Así, la identificación de dianas genéticas para conseguir resistencia a este virus tiene un gran interés aplicado. Por otra parte, el sistema experimental PepMV/tomate está adquiriendo una importancia creciente, por lo que profundizar en el conocimiento de los aspectos moleculares de la interacción PepMV/tomate tiene, en sí mismo, un importante interés de tipo fundamental. En el primer capítulo de esta tesis, se describe la identificación de 21 proteínas de tomate que interaccionan con alguna de las proteínas de PepMV mediante un escrutinio en levadura, utilizando una genoteca de ADNc normalizado de plantas de tomate sanas e infectadas. El silenciamiento génico inducido por virus (virus induced gene silencing, VIGS) de los genes que codificaban estas proteínas no resultó en signos fenotípicos diferentes al de las plantas de genotipo silvestre (wild type, WT) en la mayoría de los casos. Las plantas silenciadas en los genes que codifican las proteínas RdRp-IP5, TGB1-IP12 y TGB2-IP18 mostraron una disminución de la acumulación de PepMV además de conservar un fenotipo similar al de las plantas WT. TGB2-IP12 estaba anotada funcionalmente como una serina/treonina quinasa, pero las otras dos proteínas no estaban anotadas. El análisis bioinformático de RdRp-IP5 sugiere que pertenece a la superfamilia de proteínas NTF2 con un posible papel en la respuesta a estreses bióticos, mientras que para TGB2-IP18 no encontró una posible función, aunque tiene un gen ortólogo en Arabidopsis thaliana anotado como parte del complejo citocromo b6f. La localización subcelular de estas proteínas fusionadas a proteínas fluorescentes mediante microscopía de barrido láser confocal en células sanas e infectadas de Nicotiana benthamiana resultó en la colocalización de RdRp-IP5 y TGB1-IP12 en estructuras similares a los complejos de replicación viral (viral replication complexes, VRCs) descritos previamente. Sin embargo, la proteína TGB2-IP18, mantuvo su localización en los cloroplastos de las células infectadas. Por último, se generaron mutantes de tomate knockout homocigóticos para los genes que codifican RdRp-IP5 y TGB1-IP12 respectivamente, y un mutante heterocigótico con un solo alelo editado para el gen que codifica TGB2-IP18 utilizando el sistema CRISPR/Cas9. En las plantas mutantes rdrp-ip5 y tgb2-ip18 no se alteró la acumulación de PepMV. Sin embargo, las plantas mutantes tgb1-ip12 infectadas mostraron un aumento de la acumulación del virus, lo que sugiriere que TGB1-IP12 pueda tener un papel durante la infección de PepMV en tomate. En el trabajo que se describe en el segundo capítulo, se obtuvieron 7 mutantes de tomate cv. Micro-Tom para los genes que codifican las proteínas interactoras de la TGB2 (TGB2-IP14-21) para analizar si alguna de estas proteínas tiene un papel durante la infección por PepMV. En los mutantes tgb2-ip19 y tgb2-ip21 infectados aumentó la acumulación del virus significativamente. TGB2-IP19 es una metiltransferasa tipo 11 dependiente de S-adenosilmetionina, mientras que TGB2-IP21 está anotada como proteína de función desconocida. El estudio in silico llevado a cabo sugiere la localización de TGB2-IP19 en el núcleo y el citoplasma y una posible implicación en la respuesta a estreses bióticos, mientras que para TGB2-IP21 se predijo una localización anclada a las membranas del retículo endoplásmico (RE) o mitocondriales y que puede que esté relacionada con algún proceso implicado en la respuesta a estrés biótico, aunque no se pudo predecir una función. En el trabajo descrito en el tercer capítulo, se expresó la TGB2 de PepMV fusionada a proteínas fluorescentes en N. benthamiana. Un análisis mediante microscopía de barrido láser confocal mostró una señal fluorescente que colocalizaba con un marcador específico de RE. La expresión de TGB2 fusionada a mRFP en plantas de N. benthamiana infectadas con PepGFPm2 resultó en la relocalización de la señal fluorescente de TGB2 al interior de los VRCs. Además, la coexpresión de TGB2 con su interactor TGB2-IP19 mostró una colocalización de la señal fluorescente en el núcleo y el citoplasma en plantas no infectadas, y una relocalización de la señal fluorescente de ambas proteínas a los VRCs en plantas infectadas con PepGFPm2
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Estudio de la evolución del espaciador ribosomal intergénico 45S (IGS45S) y otras familias de ADN repetido en plantas, mediantes técnicas moleculares y citogenéticas
(2014-06-04) Galián Megías, Jose Antonio; Rosselló Picornell, Josep Antoni; Rosato, Marcela; Facultad de Biología
El objetivo fundamental de esta tesis fue ahondar en los procesos de evolución molecular de algunas de las distintas familias de ADN repetido que se usan de forma rutinaria en los trabajos de taxonomía, filogeografía y filogenética de plantas, para con herramientas de biología molecular (PCR, clonación, secuenciación…) y citogenética molecular (FISH) poner a prueba las teorías generalmente aceptadas sobre los procesos de variación y homogeneización de tales secuencias repetidas. En el primer trabajo de esta tesis como compendio de artículos, utilizando la secuencia de ADN satélite E180 previamente descrita para el género Medicago, diseñamos primers específicos para (1) evaluar la robustez y sensibilidad tanto de la PCR como del FISH para detectar familias de ADN repetido, (2) obtener nuevos datos sobre la evolución genómica (cariotípica) del género Medicago usando ADNsat como marcador, y (3) evaluar el rastro filogenético dejado por una familia de ADNsat en un género tan particular como Medicago, donde se tiene la evidencia de que complejos patrones de hibridación han jugado un papel fundamental en su historia evolutiva. Nuestros resultados demuestran que la detección tanto por técnicas moleculares como citogenéticas de la familia repetida E180 es altamente reproducible a través del género, y que los patrones cromosómicos sirvieron para diferenciar complejos de especies estrechamente relacionados (son taxón-específicos). El segundo trabajo de esta tesis vino motivado por las continuas referencias bibliográficas que usaban las secuencias de la familia de ADN ribosomal nuclear 5S como marcador genético en la práctica de concatenar partes diferentes de dos genes seguidos para usarlas como pertenecientes a un mismo gen, en la creencia de que la homogeneización de secuencia dentro de la familia era completa. En consecuencia comparamos la integridad de la secuencia (longitud, motivos universales conservados y estructura secundaria) y el comportamiento filogenético de zonas 5S codificantes completas en comparación con las quiméricas (concatenadas) de un grupo de genes de ADNrn 5S obtenido de varias especies estrechamente relacionadas. Los resultados que se desprenden sugieren que la homogeneización de secuencias no está operando, ni siquiera dentro de un mismo tándem, en la región codificante del ADNrn 5S, la cual había sido tradicionalmente considerada como un ejemplo de secuencia altamente conservada. De esta manera, la generalizada práctica de concatenar secuencias de genes 5S puede incrementar la diversidad haplotípica, distorsionando los patrones de evolución génica y conduciendo a relaciones haplotípicas incorrectas en algunas reconstrucciones evolutivas. En el tercer y último trabajo de la tesis, estudiamos la secuencia del espaciador intergénico (IGS) del ADNr 45S de Ginkgo biloba y Medicago arborea respectivamente. En el caso de G. biloba, y basándonos en trabajos previos, intentamos discernir si las familias de ADNrn 45S y 5S estaban o no combinadas en el mismo locus. Usando técnicas de citogenética molecular y secuenciación de ADN mostramos que la única organización existente en esta especie es la asociada (primera vez que se demuestra en gimnospermas), donde el gen 5S aparece insertado dentro del IGS 45S.
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Estudio de la regulación de los sistemas implicados en la absorción y translocación de potasio en Arabidopsis thaliana L. y Solanum lycopersicum L
(Universidad de Murcia, 2019-01-21) Ródenas Castillo, Reyes; Rubio Muñoz, Francisco; Martínez López, Vicente; Escuela Internacional de Doctorado
OBJECTIVOS El objetivo fundamental de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar en el conocimiento de los sistemas de absorción de potasio (K+) en las plantas mediante el estudio de los procesos fisiológicos y mecanismos moleculares implicados en la misma, en la especie modelo Arabidopsis thaliana y en la especie de interés agronómico Solanum lycopersicum. En este contexto, se han abordado los siguientes objetivos específicos: 1- Estudio del efecto de la deficiencia de nitrato (NO3-), fosfato (PO43-) o sulfato (SO42-) sobre la adquisición y translocación de K+, en plantas de Arabidopsis y tomate, en el rango de alta y baja afinidad. 2- Estudio de los mecanismos implicados en la regulación transcripcional/postranscripcional del transportador de alta afinidad HAK5 en respuesta a la deficiencia de K+ en las plantas de Arabidopsis y tomate. 3- Estudio de la influencia de la presencia de cesio (Cs+) sobre la absorción de K+ e identificación de sistemas implicados en la absorción de Cs+ en las plantas de tomate. 4- Estudio transcriptómico de plantas de tomate sometidas a ayuno de K+. METODOLOGÍA Para la consecución de los objetivos planteados se ha recurrido a distintos tipos de material biológico, y a numerosas técnicas de fisiología vegetal y biología molecular, resumidas a continuación: 1. Material biológico y condiciones de crecimiento: Las bacterias (Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens), levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y plantas (A. thaliana, S. lycopersicum y Nicotiana benthamiana), se crecieron en los medios y condiciones adecuados en cada caso. 2. Métodos: -Determinación de la capacidad de absorción de K+/Cs+ y contenido mineral interno en las plantas. -Métodos de cruzamiento y transformación de plantas de Arabidopsis. -Manipulación de ácidos nucleicos y proteínas. -Ensayo de RNA-seq. CONCLUSIONES 1. Las deficiencias de nitrato, fosfato o sulfato reducen la absorción de K+ en el rango de baja afinidad en Arabidopsis y tomate, y también disminuyen su translocación de raíz a parte aérea. En el rango de alta afinidad, la deficiencia de NO3-, PO43- o SO42- inducen la transcripción del gen HAK5 pero únicamente se produce la activación del transportador cuando hay deficiencia de K+, tanto en Arabidopsis como en plantas de tomate. 2. La presencia de altos niveles de calcio (Ca2+) en el medio externo revierten la represión de la absorción de K+ de alta afinidad ocasionada por la presencia de sodio (Na+) en plantas de tomate. 3. El etileno y las especies reactivas de oxígeno (ROS) participan en la vía de señalización de la respuesta a la deficiencia de K+, en raíces de plantas de tomate. 4. El transportador de alta afinidad de Arabidopsis, AtHAK5, se regula a nivel postranscripcional mediante un mecanismo de fosforilación por el complejo AtCIPK23/CBL1. El dominio C-terminal de AtHAK5 parece estar implicado en los mecanismos de regulación postraduccional. La formación de multímeros de AtHAK5 podría constituir otro mecanismo de regulación postraduccional del transportador. Los aminoácidos G, Y, G, D presentes en el dominio N-terminal de AtHAK5 constituyen residuos imprescindibles para su función. 5. Cuando el Cs+ está presente en el medio externo a concentraciones milimolares es absorbido por las plantas de tomate mediante un sistema de transporte sensible a Ca2+; mientras que cuando está presente a concentraciones micromolares y en condiciones de bajas concentraciones externas de K+, su absorción parece ser mediada por el transportador de K+ de alta afinidad, SlHAK5. 6. El análisis transcriptómico realizado en raíces de plantas de tomate ayunadas de K+, revela elementos comunes con la vía de señalización de la deficiencia de K+ descrita en Arabidopsis, así como elementos que parecen específicos de tomate. En la raíz, parte aérea y fruto de las plantas de tomate se han identificado transcritos cuya expresión se modifica en más de una parte de la planta en respuesta a ayuno de K+, indicando su importancia en la señalización por bajo K+ en la planta.
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Factores moleculares implicados en el sistema de incompatibilidad floral en almendro [Prunus dulcis (Miller) D.A. Webb]
(Universidad de Murcia, 2018-02-13) Gómez González, Eva Mª; Ortega Pastor, Encarnación; Dicenta López-Higuera, Federico; Facultad de Biología
A lo largo de la evolución, las plantas con flores han desarrollado un mecanismo genético de reconocimiento y rechazo específico del propio polen. Aunque desde el punto de vista evolutivo la autoincompatibilidad supone una ventaja, es un inconveniente en el cultivo de frutales, ya que puede limitar la producción. El almendro presenta autoincompatibilidad de tipo gametofítico, controlada por el locus S, que contiene al menos dos genes, expresados en el pistilo y en elpolen. El gen S del pistilo codifica para una glicoproteína con función ribonucleasa (ARNasa-S) que degrada específicamente el ARN del tubo polínico incompatible inhibiendo su crecimiento. El gen S del polen (SFB) codifica para una proteína con un dominio caja-F, que interviene en la degradación de proteínas mediante la vía del proteosoma 26S. Aunque la especificidad del rechazo del polen está controlada por el locus S, diversos estudios indican que existen genes modificadores no ligados a este locus que son indispensables en la vía bioquímica del sistema de incompatibilidad gametofítico. A pesar de que el almendro es una especie de origen autoincompatible, en la región italiana de Apulia se han identificado algunas variedades autocompatibles. En estas variedades el fenotipo autocompatible se asocia a la presencia de la ARNasa-Sf, sin embargo recientemente se han caracterizado almendros con el haplotipo Sf pero fenotipo autoincompatible lo que parece indicar la presencia de factores modificadores. El objetivo de esta Tesis Doctoral es avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares de la incompatibilidad floral en almendro mediante la caracterización fenotípica, molecular, transcriptómica y proteómica de variedades y selecciones de almendro con haplotipo Sf y distinto fenotipo. Para ello se han empleado técnicas de secuenciación de ADN, que junto con técnicas que tienen como base la PCR han permitido conocer la secuencia de la región promotora de la ARNasa-Sf, de la ARNasa-Sf y de la región entre los genes ARNasa-Sf y SFBf. Por otro lado, también se han aplicado técnicas de retrotranscripción, de detección de actividad ribonucleasa y de microscopía de fluorescencia que nos han permitido observar el comportamiento de los elementos conocidos del sistema de incompatibilidad en almendro. Estos ensayos moleculares se han combinado a su vez con otros realizados en campo para caracterizar el fenotipo de las distintas variedades y selecciones utilizadas. Con el fin de caracterizar el perfil trancriptómico del sistema de incompatibilidad se han realizado análisis de RNAseq sobre pistilos polinizados y sin polinizar, confirmándose posteriormente los resultados mediante qPCR. La caracterización proteómica del sistema de incompatibilidad se realizó mediante iTRAQ de anteras, pistilos no polinizados y polinizados. Los resultados obtenidos de la caracterización fenotípica han mostrado una relación de incompatibilidad unilateral para el haplotipo Sf debido a una disfunción en el pistilo. Sin embargo, los ensayos de actividad ribonucleasa confirman que sólo están activas las ARNasas-Sf de las variedades incompatibles, aunque ambas ARNasas-Sf se transcriben. La secuenciación de ADN ha confirmado que las secuencias de las ARNasas-Sf y de sus regiones promotoras son iguales. Sólo se ha observado la insercción de timinas en la región intergénica, que podrían ser responsables de la transcripción diferencial de un ORF descrito por primera vez en esta zona. Los análisis de transcriptómica y proteómica han ofrecido una visión general de todos elementos involucrados en las reacciones de incompatibilidad y han mostrado varios candidatos como posibles factores modificadores del sisitema de incompatibilidad. Over the evolution, the plants with flowers have developed a genetic mechanism of specific recognition and rejection of self pollen. Although from the evolutionary point of view self-incompatibility is an advantage, for fruit trees it may be a disadvantage for, since it limits their production. Almond presents gametophytic self-incompatibility controlled by the S locus, which at least contains two genes. The pistil S gene encodes a glycoprotein with ribonuclease function (S-RNase), which specifically degrades the RNA of the incompatible pollen and inhibits its growth. The pollen S gene (SFB) codes for an F-box protein involved in the degradation of proteins by the 26S proteosome. Although the specificity of pollen rejection is controlled by the S locus, several studies indicate that modifier genes not linked to this locus are involved in the biochemical pathway of the gametophytic incompatibility system. Despite the almond is a self-incompatible species, in the Italian region of Apulia some self-compatible cultivars have been identified. In these cultivars the self-compatible phenotype is associated with the presence of the Sf RNase, however, almonds with the Sf haplotype and a self-incompatible phenotype have recently been characterized, what seems to indicate the presence of modifier factors. Therefore, the objective of this PhD Thesis is to advance in the knowledge of the molecular mechanisms of floral incompatibility in almond through the phenotypic, molecular, transcriptomic and proteomic characterization of almond cultivars and selections with the Sf haplotype but a different phenotype. For this, DNA sequencing techniques have been used, which together with PCR-based techniques allowed to know the sequence of the promoter region of the Sf-RNase, the Sf-RNase and the region between Sf-RNase and SFBf genes. On the other hand, retrotranscription, detection of ribonucleases activity and fluorescence microscopy techniques have also been applied, which allowed to observe the behavior of the known elements of the self-incompatibility system in almond. These molecular assays have been combined with field assays to characterize the phenotype of the different almond selections and cultivars used. In order to characterize the transcriptomic profile of the incompatibility system, RNAseq analyzes were performed on pollinated and non-pollinated pistils. The results are then confirmed by qPCRs. The proteomic characterization of the incompatibility system was performed by iTRAQ of anthers, non-pollinated and pollinated pistils. The results obtained from the phenotypic characterization have shown a unilateral incompatibility relation for the Sf haplotype due to a dysfunction in the pistil. However, ribonuclease activity assays confirmed that only the Sf-RNase of the incompatible selections were active, although both Sf-RNases were transcribed. DNA sequencing confirmed that the sequences of the Sf-RNase and those of their promoters were identical. Only thymines insertion of three into the intergenic region was observed, which could be the responsible for the differential transcription of an ORF, firstly described in this region. Transcriptomic and proteomic analyzes have provided an overview of all elements involved in incompatibility reactions and have shown some candidates as putative incompatiblity system modifier factors.
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Función de la Tiorredoxina (TRXo1) mitocondrial y nuclear : avances en su implicación en señalización y estrés salino
(Universidad de Murcia, 2020-01-09) Sánchez Guerrero, Antonio María; Sevilla Valenzuela, Francisca; Jiménez Hurtado, Ana María; Escuela Internacional de Doctorado
Las tiorredoxinas (TRXs) son componentes clave para el control redox del metabolismo de las plantas, siendo pequeñas proteínas ubicuas que albergan un dominio activo ditiol involucrado en el intercambio tiol/disulfuro con el que regulan estructura y actividad de proteínas diana. Las TRXs extraplastidiales incluyen el tipo TRXo1 localizado en las mitocondrias y en núcleo, con un papel mucho menos conocido que el de sus homólogas cloroplastídicas. En esta Tesis Doctoral, con el fin de obtener más información sobre la función fisiológica y metabólica de la tiorredoxina de doble localización TRXo1, analizamos algunos procesos en los que están involucradas proteínas diana tanto mitocondriales como nucleares, así como los cambios metabólicos en los genotipos de Arabidopsis salvaje (WT), knockout (KO) y sobre-expresante (OEX) de Attrxo1 bajo condiciones de estrés salino (100 mM NaCl). Analizando mitocondrias aisladas comprobamos que los mutantes KO mostraron alteraciones en las actividades de los componentes del ciclo ascorbato-glutatión y en la partición electrónica respiratoria in vivo hacia las vías citocrómica (COX) y alternativa (AOX, diana de TRXo1), así como en el patrón de isoenzimas AOX, lo que indica una reorganización de los diferentes sistemas antioxidantes y respiratorios en salinidad. Además, la disminución de los niveles de glucosa y fructosa en estos mutantes coincidió con un aumento de la respiración a través de COX en condiciones control. Tras la identificación de la proteína PYR1 (Pyrabactin Resistance 1) receptora de ácido abscísico (ABA) como posible diana de TRXo1 en el núcleo, en esta Tesis hemos corroborado la interacción de ambas proteínas mediante ensayos in vitro (dot-blot trampa y co-inmunoprecipitación), así como in vivo (complementación bimolecular fluorescente).Además, el análisis in vitro de actividad PYR ha evidenciado la regulación redox por TRXo1 de este receptor. Paralelamente, se ha realizado un estudio para evaluar la sensibilidad de los mutantes KO y OEX a diferentes concentraciones de ABA exógeno, analizando el movimiento estomático yla capacidad de germinación. Las diferencias encontradas entre el genotipo WT y los mutantes han mostrado la posible participación de la TRXo1 en la regulación deambos procesos, que podría responder entre otros aspectos, a su interacción con PYR1. A fin de analizar el efecto que pueda tener la falta y sobre-expresión de TRXo1 sobre procesos derivados del funcionamiento estomático como es el de la fotosíntesis, se ha estudiado en los mutantes su respuesta fotosintética, metabólica y estomática. Se han observado diferencias entre los genotipos tanto en condiciones control como salinas, en términos de desarrollo y movimiento estomático donde la TRXo1 parece estar implicada, tales como una menor densidad de estomas maduros en plantas KO en control y en plantas KO y OEX en salinidad.En cuanto a la apertura estomática, los contenidos elevados de NO y ABA de los mutantes en condiciones salinas, no se reflejaron en un mayor cierre estomático, lo que podría responder a procesos de regulación por modificaciones post-traduccionales sobre elementos de la ruta de señalización de ABA en la que podría estar implicada la TRXo1, como es la percepción de la hormona. Por otro lado, no descartamos la influencia en la dinámica estomática de los cambios metabólicos producidos en ambos mutantes por la alteración en los contenidos en TRXo1.Estos cambios sin embargo no afectan la respuesta fotosintética, que es similar en los tres genotipos. Los objetivos alcanzados en esta Tesis Doctoral suponen un avance en el estudio de la función fisiológica y metabólica de la TRXo1, profundizando en el conocimiento de sus funciones mitocondriales y nucleares, demostrando su implicación en procesos como el desarrollo estomático y la respuesta a ABA, ambos clave en la adaptación al estrés salino.
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Identificación de las acuaporinas de Brassica oleracea L. var. italica y su potencial uso como marcadores de estrés abiótico
(Universidad de Murcia, 2024-11-29) Nicolás Espinosa, Juan; Carvajal Alcaraz, Micaela; Escuela Internacional de Doctorado
La tesis "Identificación de las acuaporinas de Brassica oleracea L. var. italica y su potencial uso como marcadores de estrés abiótico" investiga las acuaporinas (AQPs) en el brócoli, un cultivo importante en la agricultura española, especialmente en la región de Murcia. El estudio surge de la necesidad de mejorar la productividad de cultivos en áreas afectadas por estreses abióticos, como la salinidad y la sequía, que se ven agravados por el cambio climático. Las acuaporinas, proteínas que facilitan el transporte de agua y solutos, son clave en la adaptación de las plantas a estos factores de estrés. El objetivo principal de la tesis es identificar y caracterizar las acuaporinas en el brócoli y estudiar su función bajo estreses abióticos como la salinidad y la variación de los niveles de boro. Además, se investiga su implicación en la fisiopatía conocida como "ceguera del brócoli", que afecta el desarrollo de la planta y reduce su productividad. Para ello, la investigación se divide en tres objetivos específicos: identificar y analizar la evolución de todas las acuaporinas en Brassica oleracea, estudiar el papel de estas proteínas bajo condiciones de estrés por salinidad y déficit o toxicidad de boro, y examinar su rol en la ceguera del brócoli mediante análisis ómicos, como la transcriptómica y la metabolómica. Los resultados obtenidos son significativos. Se identificaron 65 genes de acuaporinas en Brassica oleracea, lo que resalta la diversidad de estas proteínas en el brócoli. El análisis evolutivo reveló que las proteínas NIP (Proteínas Intrínsecas Nodulina-26) tienden a duplicarse, lo que sugiere su importancia en la respuesta de las plantas a los estreses abióticos. Entre las acuaporinas más expresadas en los tejidos se destacan las proteínas BoiPIP1-2a y BoiPIP1-2b. En cuanto al estudio del papel de las acuaporinas frente a la salinidad y el boro, se observó que el estrés combinado de salinidad y deficiencia de boro redujo significativamente la biomasa de las plantas, lo que indica una respuesta específica a esta combinación de estreses. Además, los patrones de expresión de las acuaporinas variaron según el tipo de estrés, lo que subraya su importancia en los mecanismos de adaptación. Se observó también que estas proteínas interactúan con los lípidos de las membranas celulares, lo que facilita la adaptación a la salinidad y los cambios en los niveles de boro. Respecto a la ceguera del brócoli, una fisiopatía caracterizada por el aborto del meristemo apical, los análisis transcriptómicos y metabolómicos revelaron alteraciones importantes en la expresión de genes relacionados con el transporte de agua y nutrientes, así como con el metabolismo de compuestos secundarios. Varias isoformas de acuaporinas y transportadores de potasio fueron identificadas como claves en las plantas afectadas por la ceguera. Estas alteraciones en la expresión de acuaporinas y la disminución en la síntesis de glucosinolatos y fenoles, compuestos esenciales para la defensa frente a estreses, sugieren que las acuaporinas están directamente relacionadas con la aparición de esta fisiopatía. En conclusión, esta tesis demuestra que las acuaporinas desempeñan un papel crucial en la adaptación del brócoli a estreses abióticos como la salinidad y el déficit de boro. Además, su implicación en la ceguera del brócoli abre nuevas oportunidades para utilizarlas como marcadores moleculares o dianas para la mejora genética de cultivos. Estos resultados ofrecen nuevas perspectivas para desarrollar estrategias que mejoren la resiliencia del brócoli a condiciones ambientales adversas, contribuyendo así a una agricultura más sostenible y eficiente, particularmente en regiones afectadas por el cambio climático.
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Interacción cucurbitáceas-virus-microbioma de pulgón en el desarrollo de enfermedades virales
(Universidad de Murca, 2025-10-28) Moya Ruiz, Celia de; Gómez López, Pedro; Sin departamento asociado; Escuelas::Escuela Internacional de Doctorado
En primer lugar, se realizó una revisión bibliográfica profunda del estado actual y distribución de los virus transmitidos por pulgón en las principales regiones productoras de cucurbitáceas en España. Tras esto se estudió (I) la distribución de los principales virus transmitidos por pulgón incluyendo aquellos que son transmitidos por mosca blanca en muestras sintomáticas de dos cultivos de cucurbitáceas de tres zonas productoras de España durante los años 2021 a 2023. CABYV y WMV fueron los virus más ampliamente distribuidos en los tres años y cultivos. Además, identificamos un nuevo polerovirus, Polerovirus PABYV, que no había sido descrito anteriormente en los cultivos de cucurbitáceas de España. Este estudio mostró que PABYV emergió en 2018 y que había permanecido oculto bajo los síntomas de amarilleo causados por CABYV. Además, con esta metodología se detectó el virus críptico Alphaendornavirus cucumis por primera en muestras de calabaza. En segundo lugar, se estudió (II) cómo el orden temporal de las infecciones mixtas podría afectar la dinámica de las poblaciones virales. Para ello, se hizo un ensayo experimental en el que se evaluó la carga viral de CABYV y WMV en plantas de melón bajo diferente orden de infección (secuencial) y de forma paralela bajo infección simultánea (co-infección). La co-infección de CABYV y WMV resultó en una mayor acumulación de ambos virus, lo que sugiere un efecto doble sinérgico. En el caso de las infecciones secuenciales, se observó que el orden temporal de la infección afecta el tipo de interacción entre estos dos virus en melón, con una interacción sinérgica cuando CABYV precede a WMV y una interacción antagónica cuando WMV precede a CABYV. Con este estudio, se destaca la importancia de las interacciones bióticas en la configuración de la epidemiología viral y la dinámica de las enfermedades de las plantas en los agro-ecosistemas. En tercer lugar, se estudió (III) cómo la combinación de factores abióticos (temperatura) y bióticos (infección viral con WMV) tienen un efecto en la respuesta de la planta (melón y calabacín con alta y baja tolerancia a estrés por temperatura) y por lo tanto en la interacción virus-planta mediante un estudio de transcriptómica por 3’ mRNA-seq. Además, se cuantificó la carga viral de WMV bajo las diferentes condiciones mencionadas. Los resultados mostraron que la carga viral de WMV fue mucho mayor en las plantas de calabacín que de melón y que además fue dependiente de temperatura y el grado de tolerancia de las plantas a esta. En cuanto a la respuesta génica de las plantas a ambos estreses, se observó que el porcentaje de genes diferencialmente expresados (DEGs) fue mayor en las plantas termo-susceptibles para ambas especies de cucurbitáceas y se encontraron DEGs exclusivos en la respuesta a la combinación de ambos estreses para las variedades termo-tolerantes y en concreto, dos genes ortólogos ligados al estrés por temperatura y por infección viral en melón y calabacín. Por último, se evaluó (IV) cómo la estructura y composición del microbioma de pulgón (A. gossypii) es alterado por su alimentación en diferentes especies de plantas y cuando están infectadas con CABYV y/o WMV, usando análisis de secuenciación del gen 16S rRNA. En este estudio, se observó que la diversidad de la comunidad de bacterias fue mayor en los pulgones alimentados en melón que en pepino por lo que el microbioma se ve fuertemente afectado por el huésped del que se alimenta. También se observó que la diversidad microbiana fue mayor en los pulgones alimentados en plantas sanas que en plantas infectadas. Los géneros más abundantes fueron Buchnera y Arsenophonus, cuyas abundancias se vieron modificadas en función de la alimentación del pulgón.
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Interacción de la TGB1 del virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) con factores de transcripción de tomate
(Universidad de Murcia, 2026-05-11) Rodríguez Úbeda, Jesús Enmanuel; Aranda Regules, Miguel Ángel; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
En esta tesis doctoral se ha estudiado la proteína 1 del bloque de tres genes (TGB) del virus del mosaico del pepino dulce (PepMV; especie Potexvirus pepini) con un interés especial en su papel en el núcleo. PepMV, perteneciente al género Potexvirus de la familia Alphaflexiviridae, es actualmente el agente causante de una pandemia en tomate cultivado, con importantes pérdidas económicas asociadas. Además de su relevancia agronómica, PepMV se ha consolidado como un modelo de referencia en virología vegetal gracias al desarrollo de numerosas herramientas biotecnológicas y la caracterización de su genoma e interacción con el huésped. La TGB1 de PepMV desempeña un papel central en distintas etapas del ciclo infectivo, incluyendo el silenciamiento de ARN, aunque muchas de sus funciones han sido inferidas por homología con virus relacionados. El objetivo de esta tesis doctoral ha sido caracterizar experimentalmente la localización subcelular de la TGB1 de PepMV, con especial interés en su función nuclear, identificando y caracterizando factores nucleares del huésped interactores de TGB1. En la primera parte de esta tesis se caracterizó la localización subcelular de la TGB1 de PepMV, determinando que se trata de una proteína soluble con una distribución núcleo-citoplásmica en células sanas, con exclusión del nucleolo, que durante la infección se acumula de forma preferente en plasmodesmos y orgánulos de replicación viral (VROs). Aunque en el VRO se concentran gran parte de las funciones asociadas la infección, la presencia consistente de TGB1 en el núcleo sugiere un papel funcional adicional en este compartimento subcelular. Para abordar esta cuestión, en la segunda parte de esta tesis doctoral, se caracterizaron factores nucleares del huésped interactores de la TGB1 de PepMV identificados a través de un escrutinio de doble híbrido en levadura. El análisis in silico de las secuencias obtenidas permitió identificar las proteínas SlALOG1 y SlbZIP42, pertenecientes a las familias de factores de transcripción ALOG y bZIP, respectivamente. Mientras que la familia bZIP participa en una amplia variedad de procesos biológicos, incluyendo respuesta a estrés tanto abiótico como biótico, la familia ALOG únicamente ha sido descrita como reguladores homeóticos del desarrollo. Tanto SlALOG1 como SlbZIP42 mostraron localización nuclear en células sanas, donde colocalizaron con la TGB1 de PepMV, y se acumularon de forma preferente en los VROs durante la infección. El análisis comparativo con otros miembros de ambas familias mostró un comportamiento diferencial. Únicamente SlALOG1, dentro de la familia ALOG, fue capaz de acumularse en los VROs, mientras que varios miembros del clado I de la familia bZIP, incluyendo SlbZIP42, pero no SlbZIP11, presentaron esta capacidad, lo que sugiere funciones específicas y no redundantes durante la infección por PepMV. Los ensayos de susceptibilidad a PepMV mostraron una acumulación viral significativamente menor en plantas slalog1 y slbzip42 respecto a plantas de genotipo WT. Además, los análisis transcriptómicos en mutantes slalog1 y slbzip42 mostraron un papel para ambas proteínas como reguladores maestros de la transcripción, implicados principalmente en procesos redox y de regulación hormonal.
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Mechanisms of speciation in bryophytes: evolutionary studies in the moss Funaria hygrometrica along environmental gradients
(Universidad de Murcia, 2021-07-06) Cruz Martínez, Elena de la; Patiño Llorente, Jairo; Ros Espín, Rosa María; Werner, Olaf; Escuela Internacional de Doctorado
El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue contribuir al conocimiento de la importancia de la geografía y el clima en la variación genética y su papel como mecanismos de especiación en briófitos con amplias distribuciones. Se utilizó como modelo de estudio el musgo cosmopolita Funaria hygrometrica. Se realizó un estudio multidisciplinar en el que se combinó el análisis de la ploidía, el estudio de la variabilidad genética mediante diversas metodologías y marcadores genéticos, genética del paisaje, análisis del transcriptoma, datos morfométricos y biogeográficos. Se emplearon muestras procedentes de cuatro áreas geográficas de España con diferentes regímenes climáticos (las provincias de Asturias, León y Murcia, y las montañas de Sierra Nevada), además de otras especies del género Funaria (F. aequidens, F. arctica, F. flavicans y F. polaris) y una muestra de F. hygrometrica de Chile. Mediante citometría de flujo se detectaron cuatro citotipos. Solo uno de ellos fue haploide y estaba presente en el 67,4% de los individuos analizados. El resto de individuos presentaban alguno de los otros tres citotipos, que eran diploides, pero con distinta cantidad de ADN. Un posible mecanismo para explicar las diferencias dentro de los diploides es el número variable de cromosomas accesorios, que se sabe que están presentes en ciertas especies de musgos. Para describir los niveles de diferenciación genética entre las poblaciones de F. hygrometrica en las cuatro áreas estudiadas se realizó el genotipado de todas las muestras recolectadas y cultivadas in vitro, por medio de la técnica genómica Genotyping by sequencing (GBS). También se llevó a cabo la secuenciación Sanger de tres marcadores genéticos (nuclear, mitocondrial y cloroplástico) en algunos individuos de Sierra Nevada. Con estos análisis se confirmó la existencia de dos genotipos claramente diferenciados: uno restringido a las zonas altas de Sierra Nevada (por encima de los 1600 m s.n.m.) y a unos pocos individuos del resto de áreas estudiadas, y otro genotipo generalista, presente en todo el gradiente altitudinal de Sierra Nevada y mayoritaro en el resto del territorio estudiado. Se observó una mayor proximidad filogenética y de expresión génica entre el genotipo de distribución restringida y la muestra de F. hygrometrica de Chile, lo que pone de manifiesto su elevada capacidad de dispersión a larga distancia, mientras que el genotipo generalista estuvo más relacionado con las otras especies estudiadas.No se observaron evidencias de hibridación entre ambos linajes genéticos, ni siquiera en localidades donde cohabitan, lo que sugiere un aislamiento reproductivo. La reproducción sexual por autofecundación en ambos grupos genómicos podría explicar la ausencia de recombinación entre ellos. Estudios de genética del paisaje para conocer la importancia de la geografía (aislamiento por distancia, IBD) versus la ecología (aislamiento por ambiente, IBE) para explicar la diferenciación genética no apoyaron la reciente colonización y expansión en Sierra Nevada. Revelaron además, que la estructura genética no se alinea con la diferenciación ambiental en poblaciones de Asturias, León y Murcia, mientras que a lo largo del gradiente altitudinal de Sierra Nevada la variable climática isotermalidad constituyó el modelo que mejor explicó la estructura genética observada. Ello apunta a que una potencial barrera, aunque no absoluta, podría restringir la dispersión o el establecimiento efectivo, lo que promovería en última instancia el aislamiento ecológico. Mediante la técnica RNAseq se comparó la expresión génica entre muestras sometidas a condiciones de estrés térmico y de control. Los datos transcriptómicos apuntaron a que podría haber diferencias en la tolerancia al estrés térmico entre los dos linajes genéticos, ya que los genes expresados diferencialmente en condiciones de estrés térmico pertenecieron a la categoría de ontología génica “Unión a proteínas desplegadas”, que consta principalmente de proteínas de choque térmico. Se observó una mayor diferencia de expresión génica intraespecífica que interespecífica. El estudio morfométrico de individuos de Sierra Nevada no mostró una diferenciación morfológica significativa entre los grupos de individuos clasificados según su identidad genética, distribución altitudinal y nivel de ploidía. Por el contrario, las especies F. aequidens, F. arctica, F. flavicans y F. polaris se distinguieron morfológicamente de F. hygrometrica a pesar de que los datos genéticos mostraron mayor proximidad a las muestras con genotipo de distribución amplia de Sierra Nevada. Esta falta de variación morfológica en F. hygrometrica apunta a que los dos genotipos podrían ser especies crípticas dentro de una morfoespecie, que parecen tener una evolución o divergencia más rápida a nivel molecular que a nivel morfológico. Una simulación de los patrones de distribución de las dos posibles especies crípticas mostró que podrían compartir el mismo hábitat, incluso si compiten fuertemente por los mismos recursos y una de ellas tiene cierta ventaja selectiva en ese hábitat, siempre y cuando lleguen a este hábitat un número suficiente de migrantes de otras localidades. Este trabajo pone de manifiesto la importancia de considerar múltiples fuentes de evidencia empírica para inferir procesos evolutivos y aplicar criterios taxonómicos en especies de briófitos de amplia distribución.
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Melon (Cucumis melo L.) aquaporins as molecular markers of resistance to abiotic stresses and physiopathies
(Universidad de Murcia, 2022-12-22) López Zaplana, Álvaro; Carvajal Alcaraz, Micaela; Bárzana González, Gloria; Escuela Internacional de Doctorado
Las acuaporinas son unas proteínas transmembrana indispensables para la vida ya que facilitan el transporte pasivo de agua y otras moléculas como CO2, H2O2, compuestos nitrogenados o metaloides. En plantas se han diversificado en cinco subfamilias: PIPs (proteínas intrínsecas de la membrana plasmática), TIPs (proteínas intrínsecas del tonoplasto), NIPs (proteínas intrínsecas homólogas a nodulina-26), SIPs (proteínas intrínsecas pequeñas) y XIPs (proteínas intrínsecas X). Además, sabe que en plantas las acuaporinas ayudan frente a la adaptación de estreses tales como la salinidad, temperatura, sequía o déficit nutricionales y podrían estar implicadas en algunas fisiopatías como el rajado o cracking, el cual consiste en un desbalance entre la presión interna y externa del fruto, generando unas rajas en su superficie e impidiendo su comercialización. Es por ello que en esta Tesis Doctoral se busca caracterizar las acuaporinas del melón (Cucumis melo L.), uno de los frutos más producidos en España, especialmente en el sureste, y que está continuamente sujeto a distintos estreses ambientales. Este objetivo se llevó a cabo identificando las acuaporinas que hay en plantas de melón mediante el análisis de su expresión en distintos tejidos, caracterizando su respuesta frente a estreses abióticos típicos de la Región de Murcia y estudiando su implicación en el rajado. Todo ello, teniendo en cuenta además los aspectos fisiológicos más importantes y llevando a cabo un previo estudio bioinformático para renombrar las acuaporinas existentes, así como desechar los fragmentos o repeticiones. En el primer capítulo que corresponde al artículo titulado “Genome-wide analysis of the aquaporin genes in melon (Cucumis melo L.)”, se identificaron las 31 acuaporinas del melón (2 PIP1s, 10 PIP2s, 8 TIPs, 8 NIPs, 2 SIPs y 1 XIP) mediante análisis filogenético, las renombramos y eliminamos duplicaciones y errores en las bases de datos, además de aportar información genómica como localización o longitud. Por otro lado, se describió el posible transporte basándonos en los motivos NPA y variaciones, el filtro de selectividad ar/R y las posiciones de Froger. Por último, se analizaron los niveles de expresión basales tanto de raíz como de hoja destacando algunas aquaporinas como CmPIP1;1, CmPIP1;2 o CmTIP1;1. En el segundo capítulo que corresponde al artículo titulado “Relationships between aquaporins gene expression and nutrient concentrations in melon plants (Cucumis melo L.) during typical abiotic stresses”, se estudiaron los patrones de expresión de acuaporinas, además de distintos parámetros fisiológicos como los potenciales, contenido mineral o la conductancia hidráulica de la raíz de plantas de melón bajo estrés salino, por déficit de micronutrientes y por alta temperatura. En general, en los tres estreses se pudo observar una disminución de la expresión de acuaporinas, principalmente en raíz. Algunas acuaporinas mostraron ser decisivas en las distintas respuestas que produjeron los estreses, como CmTIP1;1, que aumentó su expresión en raíz frente salinidad y alta temperatura, mientras que disminuyó en hoja frente al estrés por déficit de nutrientes. Por último, en el tercer capítulo que corresponde con el artículo titulado “Aquaporins involvement in the regulation of melon (Cucumis melo L.) fruit cracking under different nutrient (Ca, B and Zn) treatments”, se encontraron dos tratamientos foliares compuestos por B, Ca y Zn y B y Zn, disminuyendo ambos la incidencia del rajado en el melón, 8.17% y 5.71% frente a una incidencia del 17.61% en los melones sin tratamientos. Además, estos tratamientos fueron capaces de modificar la expresión de acuaporinas en la pulpa del melón. Por último, se pudo ver como algunas acuaporinas principalmente relacionadas con el transporte de agua (CmPIP1;1, CmPIP1;2, CmPIP2;8, CmPIP2;10, CmTIP1;1, CmNIP2;2 y CmNIP5;1) estaban directamente implicadas con la aparición de esta fisiopatía.
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Modulación del ácido abscísico en plantas de tomate: respuesta integral a la combinación de estreses abióticos
(Universidad de Murcia, 2025-02-12) Pardo Hernández, Miriam; Rivero Vargas, Rosa María; Escuela Internacional de Doctorado
La presente tesis doctoral aborda la complejidad de las respuestas de las plantas a múltiples estreses abióticos y destaca cómo las combinaciones de estos factores ambientales generan respuestas únicas que no pueden deducirse a partir del estudio de estreses individuales. En este contexto, el ácido abscísico (ABA) actúa como un regulador clave en la respuesta de las plantas al estrés abiótico. En este trabajo nos focalizamos en entender las respuestas tanto dependientes como independientes de ABA, ya que este conocimiento es necesario para la identificación de marcadores directamente implicados en la adaptación de las plantas a situaciones complejas como el cambio climático. En primera instancia, en el Capítulo I, se utilizaron las hojas del mutante de tomate deficiente en ABA, flacca (flc), para evaluar la respuesta de las plantas a salinidad, altas temperaturas y su combinación. Un análisis profundo del transcriptoma reveló que la combinación de salinidad y altas temperaturas indujo una reprogramación significativa de la expresión génica. Entre estos genes, se identificaron varios factores de transcripción independientes de ABA que pertenecen a la familia R2R3-MYB y directamente relacionados con la biosíntesis de flavonoles, sugiriendo su papel en la adaptación de las plantas a estreses combinados. Por otra parte, en el Capítulo II se demuestra cómo los análisis multiómicos realizados en las hojas de mutantes flc bajo las mismas condiciones estresantes daban lugar a cambios significativos en la fenómica (biomasa y fotosíntesis), la ionómica, la metabolómica y la transcriptómica y permitió la identificación de marcadores exclusivos de cada condición de estrés que no se detectaron cuando cada ómica fue estudiada por separado. Además, en el Capítulo III se estudiaron como las raíces de los mutantes flc respondían a condiciones control, salinidad, altas temperatura y salinidad + altas temperaturas a nivel ionómico y metabolómico y se demostró que el ABA juega un papel fundamental en la regulación de la homeostasis iónica y el metabolismo de compuestos secundarios, como los fenilpropanoides y los terpenoides. Asimismo, se observó que la combinación de salinidad y altas temperaturas intensificaba la vulnerabilidad de los mutantes flc, con alteraciones significativas en la acumulación de iones y metabolitos que no se presentaron en las plantas sometidas a estreses simples. Esto resalta la complejidad de la respuesta de las plantas a estreses simultáneos y la importancia de ABA en la modulación de estas respuestas. Paralelamente se realizó un estudio para evaluar si la aplicación exógena de ABA a mutantes flc producía su recuperación a nivel fenotípico y molecular (transcritos, metabolitos e iones). Nuestros resultados demostraron que estos mutantes no recuperaban por completo el fenotipo silvestre, pero sí desencadenó una reprogramación celular específica a nivel transcriptómico, metabolómico e iónico. Por último, en el Capítulo IV exploramos cómo el ABA regula la respuesta de plantas de tomate (variedad comercial Rheinlands Ruhm) a estreses abióticos (salinidad, déficit hídrico y su combinación) en condiciones de campo y en distintas estaciones (otoño-invierno y primavera-verano). Se evaluó el rendimiento y el metabolismo de frutos de tomate en plantas silvestres y en los mutantes flc. Los resultados mostraron que las respuestas metabólicas variaron según la estación y el estrés aplicado. Además, la deficiencia de ABA provocó cambios significativos en la síntesis de compuestos fenólicos. En resumen, estudiamos las respuestas de la interacción multifactorial entre el ABA, las condiciones ambientales y el metabolismo de la planta. En conjunto, esta tesis doctoral destaca la importancia de estudiar factores de estrés combinados para identificar marcadores y rutas dependientes e independientes de ABA que fortalezcan la resistencia de las plantas al cambio climático, promoviendo así una agricultura sostenible y resiliente para escenarios futuros.
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Tiorredoxina o1 mitocondrial y nuclear : implicación en autofagia, señalización hormonal y en persulfuración bajo estrés salino
(Universidad de Murcia, 2023-09-21) De Brasi Velasco, Sabrina Analía; Jiménez Hurtado, Ana María; Sevilla Valenzuela, Francisca; Escuela Internacional de Doctorado
Las tiorredoxinas, proteínas de bajo peso molecular, tienen un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis redox celular. Estas enzimas se caracterizan por presentar un sitio activo conservado (WCGCP) compuesto por dos residuos de cisteína a través del cual regulan la estructura y función de sus proteínas diana específicas mediante reducción de residuos de Cys oxidados en puentes disulfuro. Las diferentes isoformas de las TRXs pueden encontrase en distintos compartimentos celulares. Concretamente, la TRXo1, objeto de estudio de esta Tesis Doctoral, presenta una localización dual, hallándose tanto en mitocondrias como en núcleo, analizándose su implicación en procesos como la autofagia celular y en procesos dependientes de la fitohormona ABA a través de la regulación de nuevas dianas proteicas. Dentro del primer Objetivo propuesto, utilizando como modelos de estudio suspensiones de células de tabaco BY-2 control y sobreexpresantes (OEX) Pstrxo1, se ha estudiado la posible implicación de TRXo1 en la viabilidad celular tras un tratamiento oxidativo con H2O2, a través de la regulación de la proteína ATG4 (Autophagy related protein 4), clave en el proceso de autofagia celular. Como resultado, se observó una elevada actividad de ATG4 en las células OEX sometidas al tratamiento oxidativo, junto con la demostrada interacción in vitro entre las proteínas ATG4 y TRXo1, sugiriendo un papel para esta tiorredoxina en el control redox de la proteína ATG4 in vivo. En este sentido, la TRXo1 se postula como un componente clave en el proceso de autofagia que tiene lugar en la respuesta de las células TBY-2 a la situación oxidativa, colaborando en el aumento de la tasa de supervivencia celular que presentan las células sobreexpresantes. Además, dentro del segundo Objetivo parcial propuesto, se analizó la regulación redox de PYR1 (Pyrabactin Resistance 1), receptor de ABA, mediada por TRXo1 y su implicación en procesos dependientes de esta fitohormona como son el crecimiento de la raíz y el cierre estomático, analizados en mutantes KO y sobreexpresantes (OEX) Attrxo1 de plantas de Arabidopsis thaliana L. ecotipo Columbia, así como en estudios in vitro con proteínas recombinantes de PYR1 wild type y mutadas en sus cisteínas, sometidas a ensayos de óxido-reducción. Se ha demostrado una regulación redox de este receptor que provoca cambios en su estado oligomérico, estando dos de sus tres cisteínas, concretamente Cys30 y Cys65, implicadas en el mismo. A su vez, el sistema tiorredoxina reductasa/ TRXo1 era capaz de rescatar la pérdida de la actividad de PYR1 por oxidación, y de esta forma su capacidad para inhibir a fosfatasas implicadas en la señalización por ABA, como es la proteína HAB1. Los estudios in vivo han corroborado que la oligomerización de PYR1 es dependiente del estado redox, encontrándose además un patrón diferencial en la oligomerización del receptor en plantas KO y sobreexpresantes Attrxo1 crecidas en presencia de ABA, comparadas con el patrón presentado por el genotipo silvestre. Todo ello permite describir por vez primera, la implicación del proceso de regulación redox por TRXo1 sobre el receptor PYR1, que puede ser un evento clave para favorecer la señalización por ABA, siendo esta tiorredoxina una buena candidata como reductor fisiológico in vivo de estos receptores en el núcleo. También, se estudia la participación de AtTRXo1 en procesos de persulfuración proteica (Objetivo 3), modificación postraduccional sobre residuos de Cys, en plantas mutantes knock out (KO) y sobreexpresantes (OEX) Attrxo1 crecidas bajo condiciones de estrés salino, presentándose por primera vez un estudio sobre patrones de persulfuración proteica producida por sulfuro de hidrógeno (H2S) en condiciones de salinidad, en el que algunas dianas de TRXo1 en mitocondrias y núcleo, así como proteínas del sistema antioxidante y del metabolismo del H2S entre otras, se encuentran diferencialmente persulfuradas en mutantes KO Attrxo1. Este patrón sugiere que TRXo1 puede ejercer un papel como posible moduladora del proceso de persulfuración en estas condiciones de estrés abiótico, aspecto interesante en el que se ahondará próximamente. Por otro lado, se han obtenido dobles mutantes de Tiorredoxina Reductasa B (NTRB) y de TRXo1 (Psntrb/trxo1) de Pisum sativum L. cv. Bonneville, por la técnica de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) y de A. thaliana (Attrxo1/ntrb) por cruzamiento de mutantes simples KO en cada uno de los genes (Objetivo 4). Se ha iniciado la caracterización de los mismos como paso previo a su empleo en los estudios dirigidos a profundizar en la participación de la regulación redox ejercida por este sistema, en la respuesta de plantas a situaciones de estrés abiótico, donde la TRXo1 tiene un papel que se evidencia cada vez más, como relevante.

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