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A novel role for the inflammasome in the regulation of hematopoiesis
(Universidad de Murcia, 2023-07-10) Rodríguez Ruiz, Lola; Pérez Oliva, Ana Belén; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
El inflamasoma es un complejo multiproteico que actúa como sensor del sistema inmunitario. Aunque este complejo ha sido ampliamente estudiado se desconoce el mecanismo por el que regula la hematopoyesis. Nuestro grupo ha demostrado previamente que el inflamasoma desempeña un papel importante en la eritropoyesis. La regulación de los niveles de GATA1 por el inflamasoma determina tanto la decisión eritroide-mieloide de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) como la diferenciación eritroide terminal. Este mecanismo está conservado en pez cebra, ratón y humano. En la presente tesis doctoral, utilizando las ventajas únicas del modelo de pez cebra para el cribado genético y farmacológico, en combinación con estudios bioquímicos y funcionales en células humanas K562, hemos demostrado que la inhibición farmacológica de caspase-1 rescata las alteraciones hematológicas en modelos de pez cebra de inflamación neutrofílica y de anemia de Diamond-Blackfan (DBA). Además, hemos identificado a NLRP1 como el inflamasoma responsable de la regulación de la decisión del linaje eritroide-mieloide de las HSPCs. Así, la inhibición genética de Nlrp1 provocó una reducción del número de neutrófilos y macrófagos, y un aumento del número de eritrocitos en larvas de pez cebra. Del mismo modo, la inhibición de este inflamasoma alivió la neutrofilia en un modelo de pez cebra de inflamación crónica. La regulación de la hematopoyesis por el inflamasoma tiene implicaciones clínicas, ya que las enfermedades inflamatorias crónicas suelen ir asociadas alteraciones hematopoyéticas. Por este motivo, hemos realizado un escrutinio de compuestos aprobados por la FDA/EMA para identificar inhibidores de NLRP1. Hemos identificado que la espironolactona inhibe específicamente la activación del inflamasoma NLRP1 en células HEK293T y, lo que es más importante, facilita la diferenciación eritroide de células K562 y HSPCs primarias humanas, y produce los mismos efectos de la inhibición genética de Caspa (caspasa a, la enzima análoga funcional de caspasa-1 humana) y Nlrp1 en el pez cebra. Además, es importante destacar que la espironolactona promovió la eritropoyesis en HSPCs de un paciente de DBA con la mutación común en RSP19 y, sorprendentemente, sin afectar a la mielopoyesis. Dado que la espironolactona es un fármaco aprobado por la FDA/EMA, resulta atractivo para su reposicionamiento en el tratamiento de la DBA. Otra cuestión importante que debe aclararse es el mecanismo de acción de la espironolactona, ya que su análogo eplerenona no consiguió inhibir el inflamasoma NLRP1 ni regular la hematopoyesis. Por consiguiente, es crucial conocer si las diferencias estructurales entre estos dos compuestos determinan su diferente actividad sobre el inflamasoma NLRP1. Finalmente, hemos observado un nivel adicional de regulación de la hematopoyesis por el inflamasoma que consiste en que GATA1 desplaza a GATA2 en el intrón 7 de CASP1 durante la diferenciación eritroide. Esta secuencia se encuentra conservada en primates indicando que podría ser importante para la regulación de la hematopoyesis en estos animales. Aunque la ausencia de este elemento en pez cebra y ratón ha dificultado en gran medida la caracterización de su relevancia y función, la deleción de los sitios de unión de GATA presentes en esta secuencia mediante la tecnología CRISPR-Cas9 en células humanas K562 ha revelado que regulaba negativamente la diferenciación eritroide terminal. Así, la línea mutante que carece de este elemento se diferenciaba más rápidamente, incluso en ausencia de hemina, y presenta unos niveles menores de la proteína GATA1. Además, ensayos de actividad luciferasa revelaron que esta secuencia tenía actividad promotora, que estaba regulada negativamente tanto por GATA1 como por GATA2, e impulsaba la transcripción de un fragmento corto tanto en las células K562 como en las HSPCs primarias. Sin embargo, deben realizarse experimentos adicionales para esclarecer el mecanismo de acción de este transcrito y si codifica una proteína o más bien actúa como un ARN no codificante.
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Abordaje de estudio genético del cáncer de ovario epitelial de alto grado sensible a derivados del platino mediante técnicas de secuenciación masiva con un amplio panel de genes
(Universidad de Murcia, 2023-10-31) García Aliaga, Ángeles; Alonso Romero, José Luis; Ruiz Espejo, Francisco; Sarabia Meseguer, María Desamparados; Escuela Internacional de Doctorado
El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico con una mayor mortalidad, representando el cáncer de ovario seroso de alto grado el 75% de esta patología, caracterizada por tener un curso agresivo y diagnosticarse en estadios avanzados. Uno de los criterios de inclusión según la Sociedad Española de Oncología Médica de alto riesgo para el síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario (SCMOH) es el diagnóstico de cáncer de ovario epitelial de alto grado no mucinoso. El SCMOH presenta un patrón de herencia autosómica dominante en genes de susceptibilidad al cáncer. Históricamente, el riesgo de SCMOH ha estado principalmente vinculado a mutaciones germinales en BRCA1/2. Sin embargo, actualmente también se encuentra asociado a genes supresores de tumores implicados en la reparación del ADN. El cáncer de ovario de alto grado se evidencia por ser genéticamente inestable y aproximadamente un 50% de estos tumores presentan deficiencia en los mecanismos de reparación del ADN mediante recombinación homóloga. El rendimiento diagnóstico obtenido en el estudio genético de CO ha sido del 22% en la población BRCA. Este dato justifica la importancia de incluir este fenotipo en los criterios de selección de la SEOM para el estudio del síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario. El estudio genético del CO, a través de un panel de genes de accionabilidad clínica relacionados con diversos síndromes hereditarios, logra aumentar el rendimiento diagnóstico con respecto solo el estudio de los genes BRCA1 y BRCA2. Por tanto, se hace necesario su inclusión en la práctica clínica. Desde un punto de vista clínico, un 52% de las variantes obtenidas han sido clasificadas como VP y un 48% como VUS. Al ampliar el estudio genético a un panel de genes, el número de VUS obtenidas se ve incrementado y pueden superar, incluso, en número a las VP. Es por ello, que el laboratorio debe de disponer de un registro actualizado de las VUS obtenidas y proceder a su reevaluación de forma periódica con el fin de lograr su clasificación clínica de forma inequívoca. Desde el punto de vista molecular, y en concordancia con la bibliografía, un 65% de las VP obtenidas han sido variantes tipo frameshift o de cambio del marco de lectura. Con respecto a las VUS obtenidas, un 87% han sido de tipo missense o con cambio de sentido, lo que dificulta su clasificación clínica en aquellos casos en donde no se disponga de información suficiente. El análisis de supervivencia del CO, en función de la respuesta al tratamiento en primera línea con derivados de platino, presenta un mejor pronóstico en el fenotipo sensible con respecto a los fenotipos parcialmente sensibles o resistentes. Este fenotipo sensible se comporta igual en presencia o ausencia de VP en los genes BRCA1/2, por lo que debe compartir características biológicas similares independientemente del genotipo BRCA. El uso de técnicas NGS para secuenciar un amplio panel de genes, genera una gran cantidad de VUS. Para facilitar y optimizar el manejo de estas variantes es indispensable el uso de algoritmos de priorización de VUS. Gracias a este algoritmo se ha podido reclasificar un 8% de las VUS obtenidas como priorizadas según las evidencias de patogenicidad, siendo una herramienta imprescindible en la práctica asistencial.
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Acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa en el intestino grueso humano: cambios en sus actividades, propiedades moleculares y cantidad de ARN mensajeros en carcinomas de colón / Mª Fernanda Montenegro Arce; directores Jesús Vidal Moreno y María Páez de la Cadena Tortosa
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A,, 2006) Montenegro Arce, María Fernanda
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Advances in the study of biomarkers in canine hypothyroidism [recurso electrónico]
(Universidad de Murcia, 2024-06-19) González Arostegui, Luis Guillermo; Cerón Madrigal, José Joaquín; Tvairjonaviciute, Asta; Peres Rubio, Camila; Muñoz Prieto, Alberto; Escuela Internacional de Doctorado
El hipotiroidismo canino es la endocrinopatía mas común en los perros, caracterizada por una alteración en la síntesis de hormonas tiroideas. Esta enfermedad suele ser diagnosticada por la medición de hormonas tiroideas en suero, sin embargo, los resultados pueden ser confusos, ya que estas hormonas fluctúan constantemente. El uso de los biomarcadores otorga nuevas oportunidades para alcanzar el diagnóstico certero de las enfermedades, conocer mas sobre su fisiopatología y además de ofrecer nuevos métodos para monitorizar los tratamientos. Esta tesis de doctorado busca contribuir al avance en el estudio de los biomarcadores de hipotiroidismo canino, ampliando nuestra comprensión sobre los biomarcadores, los métodos usados para el estudio de estos y sus posibles aplicaciones prácticas. Los objetivos específicos son los siguientes: • Objetivo 1: Realizar una revisión sistemática sobre los artículos publicados existentes relacionados con biomarcadores identificados a través del uso de análisis proteómicos en perros. • Objetivo 2: Realizar un análisis proteómico usando suero y saliva de perros hipotiroideos y sanos, para identificar posibles biomarcadores de hipotiroidismo canino. • Objetivo 3: Realizar un análisis metabolómico no dirigido usando suero de perros hipotiroideos y sanos, y un análisis metabolómico dirigido usando saliva de perros hipotiroideos y sanos para identificar posibles biomarcadores de hipotiroidismo canino. • Objetivo 4: Validar la determinación de antioxidantes y oxidantes en dos nuevos tipos de muestra, como son; sangre entera y lisados eritrocitario. • Objetivo 5: Evaluar el estado redox en suero, saliva, sangre entera y lisados eritrocitarios de perros hipotiroideos, comparándolo con el estado redox de perros con enfermedad no tiroideas y perros sanos. Para alcanzar estos objetivos, se utilizó la siguiente metodología: • Las muestras de saliva fueron recolectadas por medio del uso de esponjas de polipropileno, mientras que las muestras de suero, sangre entera y lisados eritrocitarios se obtuvieron mediante la punción de la vena yugular. • Se realizaron análisis proteómicos en las muestras de suero y saliva de perro usando técnicas de proteómica líquida y espectrometría de masas. • Se realizaron análisis metabolómicos no dirigidos en las muestras de suero y dirigidos en las muestras de saliva, por medio de kits, cromatografía líquida y espectrometría de masas. • Los biomarcadores del estado redox se evaluaron por medio de métodos espectrofotométricos usando un analizador automatizado y un lector de placas. Los principales resultados y conclusiones especificas de esta tesis de doctorado son: 1. En la revisión desarrollada sobre los estudios proteómicos publicados en perros, se encontró que, para estos, se utilizan varios tipos de muestras para evaluar el proteoma en esta especie, especialmente suero y saliva. El uso de los análisis proteómicos para evaluar las enfermedades puede permitir la detección de nuevos biomarcadores, así como esclarecer nuevas rutas fisiopatológicas en el campo de las enfermedades endocrinas. 2. El hipotiroidismo produce cambios en el proteoma de la saliva y el suero de los perros. Los cambios en saliva reflejan el descenso en la tasa metabólica, la presencia de estrés oxidativo, y de alteraciones inmunológicas y dermatológicas, mientras que, los cambios en suero podrían reflejar la reducción en la síntesis de proteínas, la coagulación y la presencia de hipercolesterolemia. En particular, la actividad de la LDH, la cual puede ser fácilmente medida a través de un ensayo espectrofotométrico, se encuentra reducía en la saliva de perros hipotiroideos en comparación a perros con otras enfermedades y perros sanos, y sirve como un nuevo posible biomarcador de hipotiroidismo canino. 3. El hipotiroidismo produce cambios en el metaboloma de la saliva y el suero de los perros. Los cambios en saliva están directamente asociados con la síntesis de hormonas tiroideas y la alteración en el metabolismo de lípidos, algunos de los metabolitos identificados, como son la tirosina y la fenilalanina podrían servir como posibles biomarcadores de hipotiroidismo canino. Los cambios en suero están asociados con la vía pentosa fosfato, la biosíntesis de aminoacil-tARN y el metabolismo de la pirimidina. Algunos de los metabolitos identificados, como son el ácido D-glucónico y la L-isoleucina podrían ser posibles biomarcadores de hipotiroidismo canino. 4. Los antioxidantes y oxidantes pueden ser medidos en sangre entera y lisados eritrocitarios de perros. Los perros con hipotiroidismo presentan un descenso en CUPRAC, TEAC y tiol, y un aumento en AOPP y TBARS en la sangre entera. También muestras un descenso en TEAC y d-ROMs, y un aumento en PON-1 en lisados eritrocitarios. Además, el hipotiroidismo produce cambios en el estado redox de la saliva, con un descenso en FRAS y un aumento en TBARS. Estos datos indican que el hipotiroidismo canino puede producir cambios en el estado redox y que este puede ser detectado usando distintos tipos de muestras.
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Análisis de biomarcadores genómicos, celulares y serológicos como predictores de rechazo o tolerancia en el trasplante renal
(Universidad de Murcia, 2024-11-20) Jiménez Coll, Victor; Muro Amador, Manuel; Botella Martínez, Carmen; Escuela Internacional de Doctorado
Objetivos: El objetivo principal de esta tesis es identificar y analizar nuevos biomarcadores que mejoren la detección precoz del rechazo y optimicen la terapia inmunosupresora en el contexto del trasplante renal. Para alcanzar este objetivo global, se plantean tres objetivos específicos: 1) Destacar, de entre los biomarcadores serológicos, celulares y genómicos emergentes, aquellos con mayor potencial para la detección temprana y precisa del rechazo en trasplantes renales. 2) Analizar la relación entre la activación de subpoblaciones de linfocitos T CD8+ y la necrosis tubular aguda (ATN) en pacientes trasplantados, y determinar si esta activación puede servir como biomarcador predictivo para identificar a los pacientes con mayor riesgo de desarrollar ATN en el primer mes postrasplante. 3) Evaluar la relación entre los niveles de antígenos de maduración de células B (BCMA) antes del trasplante y la reactivación temprana del citomegalovirus (CMV) en pacientes trasplantados, y analizar si los niveles elevados de BCMA pueden predecir una mayor carga viral de CMV tras el trasplante. Metodología: Este trabajo incluyó una revisión bibliográfica y dos estudios observacionales prospectivos en pacientes que recibieron trasplante renal. La revisión bibliográfica se basó en estudios publicados en los últimos 10 años en revistas revisadas por pares, centrados en biomarcadores serológicos, celulares y genómicos con aplicaciones clínicas en el trasplante renal. Para la búsqueda se utilizaron bases de datos científicas reconocidas como PubMed, Scopus y Web of Science. El primer estudio experimental incluyó a 31 pacientes trasplantados renales y 17 controles sanos. Se recolectaron muestras de sangre periférica durante el primer año postrasplante en diversos momentos: semanas 1 y 2, y meses 1, 2, 3, 6 y 12. Las células mononucleares fueron aisladas mediante gradiente de densidad y analizadas por citometría de flujo para cuantificar subpoblaciones de linfocitos T CD8+, midiendo los marcadores de activación CD25, CD69 y CD95. El segundo estudio incluyó a 30 pacientes seropositivos para CMV-IgG, todos ellos con injertos funcionantes al menos un mes después del trasplante. Los pacientes fueron seguidos durante los tres primeros meses postrasplante para monitorizar la reactivación del CMV mediante qPCR. Se recolectaron muestras de sangre periférica con EDTA antes del trasplante y a los 3 y 6 meses postrasplante. Las células leucocitarias se aislaron y se evaluaron los niveles de transcripción de BCMA, BAFF-R, TACI y otros marcadores mediante qPCR. Además, se analizaron las subpoblaciones de linfocitos B mediante citometría de flujo. Conclusiones: Los biomarcadores serológicos, celulares y genómicos emergentes han demostrado un gran potencial para mejorar la detección temprana y precisa del rechazo en trasplantes renales, superando las limitaciones de los métodos tradicionales. En particular, la activación de los linfocitos T CD8+, evaluada a través de los marcadores CD25, CD69 y CD95, se asocia directamente con la aparición de ATN en receptores de trasplante renal, lo que sugiere que estas células desempeñan un papel crucial en la lesión inmunomediada del injerto durante las primeras etapas postrasplante. Los niveles elevados de estos marcadores demostraron ser altamente predictivos para identificar a los pacientes con mayor riesgo de desarrollar ATN. Además, los niveles elevados de transcripción de BCMA antes del trasplante en pacientes receptores de injertos renales están asociados con la reactivación temprana del CMV postrasplante. La medición de estos niveles podría ser utilizada como un biomarcador clínico para predecir el riesgo de reactivación viral, facilitando una mejor gestión de las complicaciones asociadas al CMV tras el trasplante renal.
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Análisis de la actividad de las catepsinas en saliva en el carcinoma epidermoide de faringe y laringe
(Universidad de Murcia, 2024-10-11) Matías Sánchez, Manuel; Díaz Manzano, José Antonio; Cabezas Herrera, Juan; Escuela Internacional de Doctorado
Objetivos: Estudio observacional de casos-control ambispectivo con el objetivo de demostrar diferencias en la actividad de las catepsinas en la saliva de pacientes afectos con un carcinoma epidermoide de faringe o de laringe, con respecto a la población sana. También se tratará de establecer un punto de corte de actividad de catepsina válido que se relacione con el diagnóstico de cáncer y con factores de mal pronóstico. Material y métodos: Se seleccionó un grupo de pacientes afectos de carcinoma epidermoide de faringe y de laringe P16 negativo, y un grupo control de voluntarios sanos sin enfermedades de la vía aérea superior. Se recogieron en ambos grupos muestras de saliva y una serie de variables epidemiológicas y clínicas de relevancia en el manejo clínico de estos pacientes. Se realizaron perﬁles de proteínas basados en actividad empleando sondas ﬂuorescentes diseñadas para las catepsinas B, L, S y X/Z, en geles de poliacrilamida de dos dimensiones sometidos a electroforesis (técnica SDS-PAGE). Resultados: Se realizaron 14 geles de poliacrilamida, donde se analizaron las 108 muestras de saliva disponibles (76 del grupo de casos, y 32 del grupo control). Se recopilaron los datos de densidad de intensidad óptica en las bandas correspondientes a las distintas catepsinas. Se obtuvo una mediana de intensidad de densidad óptica de 191,3 (77,6-336,5) para la catepsina B; de 432,8 (232,9-899,6) para la catepsina S; y de 68,8 21,7-200,9) para la catepsina L. No se halló actividad de catepsina X/Z relevante en las muestras. Se encontraron diferencias entre el grupo de casos y el grupo control en la actividad de la catepsina S (p<0,01) y de la catepsina L (p<0,01); pero no así de la catepsina B (p<0,99). Empleando los niveles de actividad de la catepsina S, se realizó una curva ROC para diagnóstico de carcinoma epidermoide, estableciendo el punto de corte en una actividad de 479,7. Se demostraron diferencias signiﬁcativas en la actividad de la catepsina S entre ambos grupos tras el análisis multivariante (p<0,03). También con los datos de actividad de la catepsina S, se realizaron curvas ROC para crear una prueba predictiva de tamaño del tumor primario avanzado (cT y pT), de presencia de metástasis ganglionares cervicales (cN y pN) y de estadio tumoral avanzado (clínico y anatomopatológico). Se hallaron diferencias en la actividad de catepsina S en los pacientes con un tumor primario avanzado (p<0,02), respecto a aquellos con tumor primario inicial; así como en los pacientes con estadio tumoral avanzado (p<0,01) respecto a los de estadio inicial. No se hallaron diferencias signiﬁcativas en la actividad de catepsina S en los pacientes N+ respecto a los N0 (p<0,43). Por último, se diseñaron curvas ROC con la actividad de la catepsina S como prueba predictiva de complicaciones postquirúrgicas y de fístula salival en pacientes laringectomizados totales. No se pudieron demostrar diferencias en ninguno de los dos casos (p<0,21 para las complicaciones globales, y p<0,16 para la fístula salival). Conclusiones: Se puede concluir que la actividad de la catepsina S salivar está elevada en los pacientes con un carcinoma epidermoide de faringe y de laringe con respecto a los pacientes sanos; mientras la actividad de la catepsina L está disminuida. La actividad de la catepsina S puede usarse como prueba diagnóstica para carcinoma epidermoide de faringe y de laringe, y como predictor de tumores primarios avanzados o estadios tumorales avanzados. No puede usarse como marcador predictivo de metástasis ganglionares cervicales ni de complicaciones postquirúrgicas.
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Análisis del microbioma-metiloma y estudio de asociación entre Fusobacterium nucleatum y marcadores moleculares en el cáncer colorrectal
(Universidad de Murcia, 2023-11-20) Escudero Jiménez, Ángel; Galán Ros, Jorge; Conesa Zamora, Pablo; Escuela Internacional de Doctorado
Objetivo: Estudio del microbioma y metiloma a partir de muestras de tejido intestinal de pacientes con CCR para establecer asociaciones entre el perfil de metilación genética a nivel de islas CpG y la abundancia relativa respecto al género Fusobacterium. A su vez, se lleva a cabo el estudio de asociación entre la cuantificación relativa de Fusobacterium nucletarum y las características clínicas y moleculares en el CCR, así como la utilidad potencial de la medición del nivel de F. nucletaum en el diagnóstico/cribado del CCR. Material y métodos: Se incluyen un total de 154 muestras emparejadas correspondientes a 77 pacientes con CCR, tanto de tejido tumoral (T) como de tejido no tumoral periférico (NT), clasificadas según tipo de CCR (CC, SAC y hmMSI), localización (proximal, distal) y estadio según criterios TNM. El estudio del microbioma bacteriano en muestras T y NT se realiza mediante tecnología NGS (IlluminaMiSeq System®). El estudio del perfil de metilación del ADN a nivel de islas CpG en muestras T se realiza mediante el array Infinium® HumanMethylation450 BeadChip y los resultados se validan por pirosecuenciación. El estado MSI se determina mediante el kit MSI Analysis System (Promega) y el estado CIMP con la técnica SALSA® MS-MLPA® Probemix ME042-C1 CIMP (MRC-Holanda). También se determinan mediante pirosecuenciación las mutaciones de los genes: KRAS, BRAF y PIK3CA. Finalmente se realiza la cuantificación bacteriana global y de F. nucletaum por qPCR. Las diferencias existentes entre muestras T y NT en cuanto a microbioma se han estudiado mediante el método PCA (Principal Component Analysis), la prueba U de Mann-Withey-Wilcoxon y el análisis LDA (“linear discrimination analysis”). El análisis de correlación de Pearson entre la abundancia relativa del género Fusobacterium y el nivel de metilación de los genes estudiados se ha realizado con la función R statscor utilizando RStudio IDE versión 1.0.143. Para el resto de análisis estadísticos, tanto del estudio de validación del porcentaje de metilación, del análisis de correlación entre la cuantificación relativa de F. nucletaum y los porcentajes de metilación, o de asociación con los distintos marcadores de interés, se ha utilizado el paquete estadístico SPSS versión 21.0. Resultados: El análisis de la diversidad de géneros bacterianos realizado entre muestras T y NT según la localización determina que existen diferencias significativas que especificamente son debidas a muestras T de localización distal, con una menor diversidad, mientras que no existen diferencias de diversidad microbiana según el tipo de CCR. El PCA de los datos de microbioma no muestra diferencias entre los casos. Entre los géneros bacterianos con diferencias significativas en su abundancia relativa entre muestras T y NT se encuentran Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium y Acinetobacter, que se presentan como los géneros con mayor poder discriminatorio en el modelo predictivo obtenido mediante el método LDA a favor de muestras T, mientras que únicamente el género Lachnoclostridium se presenta como género en el modelo predictivo a favor de muestras NT. El estudio de validación realizado a partir de los datos obtenidos por el análisis de correlación para el nivel de metilación genético y la abundancia relativa del género Fusobacterium ha confirmado una correlación positiva con la metilación de los genes PLCH1, mirLET7D, EGFR y COBL. En cambio el nivel de F. nucletaum ha mostrado correlación positiva únicamente con el gen ZNF788. No se encuentran diferencias en la cuantificación de F. nucletaum en cuanto a sexo y localización. Existen diferencias significativas entre CC y SAC/hmMSI que se dan a nivel proximal, y entre los tumores de mayor tamaño (T3, T4) o estadios avanzados (II, III, IV) frente a los de menor tamaño (Tis, T1, T2) o estadio (0, I). También existen diferencias significativas entre MSS y MSI-H, entre CIMP-H y CIMP-L, y para los estados mutados de los genes KRAS y BRAF, mientras que no se encuentran para PIK3CA. El análisis multivariante confirma que el estado MSI, estadio CCR y el tipo de CCR son las variables que presentan asociación significativa de forma independiente con la cuantificación relativa de F. nucletaum. La cuantificación relativa de F. nucletaum presenta una eficiencia diagnóstica para CCR del 69%. Se establece el punto de corte óptimo en una diferencia ≤ 10 ciclos en Ct de F. nucletaum y Ct de carga bacteriana total obtenidos por qPCR. El modelo predictivo establece que la cuantificación relativa de F. nucletaum es predictor independiente de CCR (OR=2,23; IC95% [1,51-3,30]) y del tipo de CCR SAC/hm-MSI frente a CC (OR=2,00; IC95% [1,22–3,28]). Conclusiones: Se han encontrado potenciales biomarcadores potenciales bacterianos para CCR (géneros Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium y Acinetobacter). Además los genes PLCH1, mirLET7D, EGFR y COBL han mostrado un estado hipermetilado asociado a la abundancia del género Fusobacterium spp. en muestras T, mientras que sólo el porcentaje de metilación del gen ZNF788 ha mostrado correlación positiva con la cuantificación relativa de F. nucletaum. El nivel de F. nucletaum se asocia de forma significativa al tipo de CCR SAC/hmMSI, estadios avanzados, estado MSI-H, estado CIMP-H y BRAF mutado, aunque el análisis multivariante confirma la asociación de forma independiente con el CCR tipo SAC/hmMSI, estadios avanzados y estado MSI-H. Debido a la buena especificidad obtenida para la cuantificación relativa de F. nucletaum se propone dicho parámetro como candidato a la mejora del cribado/diagnóstico del CCR mediante técnicas no invasivas, incluso llegando a poder diferenciar entre CC y SAC/hmMSI.
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Análisis funcional de la producción de compuestos con actividad antitumoral a partir de cultivos celulares sometidos a elicitación / Lorena Almagro Romero; directora, María Angeles Pedreño García.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Biología Molecular y Biotecnología,, 2011) Almagro Romero, Lorena
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Antithrombin role beyond hemostasis
(Universidad de Murcia, 2024-10-11) Peñas Martínez, Julia; Martínez Martínez, Irene; Escuela Internacional de Doctorado
La antitrombina es una glicoproteína secretada principalmente por el hígado y perteneciente a la superfamilia de las serpinas, que son inhibidores de serín proteasas, como algunas proteínas de la cascada de la coagulación, siendo, de hecho, el principal inhibidor fisiológico de esta cascada. La antitrombina tiene gran flexibilidad estructural, permitiéndole inhibir proteasas de la coagulación y adoptar distintas conformaciones: nativa, activada por heparina, rota, latente y prelatente. Las conformaciones latente y prelatente, con el loop reactivo internalizado en la lámina beta central, se forman in vitro al incubar la antitrombina nativa a temperaturas elevadas. La prelatente conserva su capacidad inhibitoria, aunque con menor afinidad por la heparina, y se presenta en vivo en bajas concentraciones. Además de su función en la hemostasia, la antitrombina tiene funciones anti-angiogénicas, anti-inflamatorias, anti-apoptóticas y anti-virales. Nuestro grupo demostró que la antitrombina activada por heparina también tiene un efecto anti-tumoral sobre células de glioblastoma, probablemente mediado por la inhibición de la enteropeptidasa. El glioblastoma es el tumor maligno primario más agresivo del sistema nervioso central en adultos, con una incidencia global menor de 10 por cada 100000 personas. A pesar de tratamientos agresivos, la mediana de supervivencia es de 12-15 meses tras el diagnóstico. Su baja tasa de supervivencia se debe a su heterogeneidad, capacidad invasiva, barrera hematoencefálica y células madre de glioma. La antitrombina, dada su diversidad conformacional y efectos pleiotrópicos, podría ser una candidata para un nuevo tratamiento del glioblastoma. Los objetivos de esta tesis han sido: 1. Caracterizar la función antitumoral de la antitrombina prelatente sobre células de glioblastoma multiforme. 2. Estudiar el mecanismo celular subyacente a la función antitumoral de la antitrombina nativa y prelatente en células de glioblastoma multiforme. 3. Identificar el receptor potencial de la antitrombina en células de glioblastoma y validar los resultados in vitro en un modelo preclínico usando organoides y muestras de pacientes con glioblastoma multiforme. Se purificó antitrombina prelatente a partir de plasma humano mediante cromatografía de afinidad por heparina, incubando antitrombina nativa a 60ºC durante 30 horas. Se caracterizaron las conformaciones nativa y prelatente evaluando la formación de complejos con FXa o trombina, y la afinidad por heparina. Se trataron células de glioblastoma U87 y/o U251 con 2.16 µM de antitrombina nativa, prelatente, o con buffer A (control), durante 11 horas. En el primer capítulo, se caracterizó la función antitumoral de la antitrombina en células U87, evaluando su interacción con la enteropeptidasa. Se determinó que la antitrombina prelatente inhibe la enteropeptidasa, aunque la nativa mostró un efecto inhibidor mayor en presencia de heparina. Se estableció que la concentración óptima de antitrombina para su efecto antitumoral es de 2.16 µM. Se observó que la antitrombina prelatente reduce la migración e invasión de células U87 sin heparina y más eficientemente que la nativa. La antitrombina prelatente también inhibe la expresión de VEGFA y STAT3, reduciendo la resistencia al tratamiento en glioblastoma multiforme. En el segundo capítulo, se estudió el mecanismo subyacente a la función antitumoral de la antitrombina prelatente. Un array de expresión mostró 2477 genes sobreexpresados y 6760 infraexpresados. Se seleccionaron 3 miRNAs alterados en el array relacionados con VEGFA para evaluar su implicación en angiogénesis, aunque no se obtuvieron resultados significativos. Se encontró que la antitrombina inhibe genes reguladores del ciclo celular como pRB y E2F4, inhibiendo la proliferación y la fase S del ciclo celular en células U87, pero no en U251. En el tercer capítulo, se identificó a la distonina como potencial receptor de la antitrombina en células U87. La antitrombina nativa y prelatente mostraron interacción con la distonina, implicada en la inhibición de la proliferación tumoral de células U87. Se evaluó la capacidad anti-invasiva de la antitrombina en un modelo preclínico con organoides y neuroesferas generadas a partir de la biopsia al diagnóstico y recaída de un paciente con glioblastoma, demostrando que ambas inhiben la invasión tumoral. Esta tesis demuestra el efecto antitumoral in vitro de las antitrombinas nativa y prelatente, asociadas con reducción de migración e invasión tumoral, menor resistencia al tratamiento, parada del ciclo celular, menor proliferación y función anti-angiogénica. La identificación de la distonina como potencial receptor podría ayudar a diseñar terapias dirigidas. Los resultados in vivo apoyarían el potencial terapéutico de la antitrombina prelatente en el glioblastoma.
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Application of antimicrobial peptides for the control of betanodavirus in European sea bass
(Universidad de Murcia, 2024-11-22) Cervera Martínez, Laura; Chaves Pozo, Elena; Cuesta Peñafiel, Alberto; Esteban Abad, María Ángeles; Escuela Internacional de Doctorado
Esta Tesis Doctoral se centra en la caracterización de péptidos antimicrobianos (AMPs) de peces teleósteos y su implicación en la respuesta inmunitaria. Concretamente, nos planteamos evaluar la capacidad inmunomoduladora de los AMPs NK-lisina (Nkl), hepcidina (Hamp) y dicentracina (Dic) de lubina y su aplicación como agentes antivirales frente a nodavirus (NNV) en lubina. La primera fase de la experimentación fue comprobar la capacidad inmunomoduladora in vitro de dichos AMPs sintéticos, derivados de lubina, en leucocitos de riñón cefálico de dorada y lubina. Se estudió la capacidad fagocítica por citometría de flujo y el estallido respiratorio por quimioluminiscencia, sin detectar regulación por dichos AMPs. En cambio, se observó, mediante qPCR, el aumento significativo de la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune antiviral en lubina y su descenso generalizado en dorada. Estos datos apuntaron a la idoneidad de los AMPs sintéticos derivados de lubina para su uso en lubina, pero no en dorada, indicando una especificidad de especie. Tras esto, se estudió la posible función y aplicación de estos AMPs en lubina mediante estudios in vivo. Al administrarlos en forma de plásmidos de expresión, estos se transcribieron en el músculo y aumentaron los niveles de dichasproteínas y la capacidad microbicida. Además, indujeron la expresión de marcadores proinflamatorios, aunque no consiguieron mejorar la supervivencia frente a infecciones con NNV. El siguiente paso fue testar los AMPs sintéticos Hamp y Dic in vivo en lubina ya que Nkl había sido previamente evaluada con resultados excelentes. Se comenzó analizando su potencial como inmunomoduladores, demostrándose una reducción en la expresión de marcadores proinflamatorios y un aumento de marcadores leucocitarios como neutrófilos, macrófagos y linfocitos B. Estas alteraciones se relacionan con una ventaja para el hospedador al luchar contra infecciones virales, por lo que se valoró su potencial como agente preventivo frente a NNV. Los resultados fueron muy satisfactorios mejorando en ambos casos la supervivencia frente al virus en un 30%. Este aumento de la supervivencia podría ser debido a la inducción de un estado antiinflamatorio en el tejido diana del virus, el cerebro, y la sobreexpresión del complejo Cxcr3/Cxcl9, que facilita la infiltración de células clave para la resolución viral como linfocitos T, neutrófilos o macrófagos. Curiosamente, la administración terapéutica de estos AMPs sintéticos tras la infección con NNV mostraron también una mejoría en la supervivencia de las lubinas tratadas con Hamp y Dic, y una inmunomodulación similar al tratamiento previo. Sin embargo, los niveles de virus no se vieron afectados, por lo que el efecto lítico directo de los AMPs sobre las partículas virales parece no ser relevante. Por el contrario, la administración de Nkl sintética solo logró retrasar la aparición de las mortalidades, pero no evitarlas, y únicamente estimuló la respuesta citotóxica, siendo esta claramente insuficiente para evitar la mortalidad por NNV. En conclusión, los péptidos sintéticos Hamp y Dic pueden ser considerados como excelentes herramientas para el control de NNV en granjas de lubina gracias a sus funciones inmunomoduladoras, tanto administrado de forma profiláctica como terapéutica.
Open Access
Bases moleculares de la interacción, de proteínas de transporte vesicular
(Universidad de Murcia, 2022-05-31) López Martínez, David; Corbalán García, Senena; Escuela Internacional de Doctorado
Las vesículas intracelulares se transportan de un orgánulo a otro en respuesta a distintos estímulos. La dirección y eficacia de la entrega de vesículas hasta su membrana de destino están mediadas por la señalización celular, llevada a cabo por numerosas proteínas y segundos mensajeros. Rabfilina3A (Rph3A) es una proteína del tráfico de membranas, sensible a dos segundos mensajeros, calcio (Ca2+) y fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato (PIP2). PKCε es una proteína quinasa implicada en rutas de señalización que actúa fosforilando a otras proteínas, y responde a distintos lípidos como diacilglicerol (DAG) y ácido fosfatídico (PA). Nuestro grupo de investigación en colaboración con el Instituto de Biología Molecular de Barcelona, han resuelto las estructuras 3D de los dominios C2 de Rabfilina3A unidos a Ca2+ y PIP2, y también del dominio C2B unido a SNAP25. Además, se determinó previamente que PKCε responde a PA. Por tanto, uno de los objetivos de esta tesis doctoral fue caracterizar la función de Rabfilina3A y descubrir nuevas proteínas moduladoras de su función. El segundo objetivo fue investigar el papel que podría tener el PA sobre PKCε en la secreción de vesículas de los mastocitos. Para lograr estos objetivos, se utilizaron técnicas de biología molecular para clonar y mutar genes. Se usaron dos líneas celulares como modelos vivos: la línea celular PC12 como modelo adrenal, también diferenciada con factor de crecimiento neuronal (NGF) a un modelo neuronal, y la línea celular RBL-2H3 como modelo de mastocitos. Se empleó el ensayo de ligación por proximidad (PLA) con microscopía confocal para estudiar la localización e interacciones proteína-proteína. Además, se utilizaron técnicas "ómicas" para la identificación masiva de proteínas cercanas a Rabfilina3A, acoplando la técnica de marcaje por proximidad dependiente de biotina (BioID2) con espectrometría de masas. Los resultados obtenidos muestran que el dominio C2B de Rabfilina3A presenta una fuerte región electropositiva, en la zona de interacción con SNAP25 que no está conservada en Sinaptotagmina1. Rabfilina3A parece interaccionar con VAMP2, Sinaptotagmina1 y SNAP25 en las vesículas de transporte, pero sólo con SNAP25 y Sinaptotagmina1 en la membrana plasmática. La zona de interacción de SNAP25 con Rabfilina3A, y la interacción de Rabfilina3A con PIP2 parecen ser claves para la correcta localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Además, la sobreexpresión de Rabfilina3A en un fenotipo neuronal promueve la localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Se caracterizó el interactoma circundante a Rabfilina3A y se descubrió que Rabfilina3A interacciona con STIM1, y Tcp11l1. STIM1 es una proteína del retículo endoplasmático (RE) encargada de detectar y ayudar a restaurar los valores de Ca2+ en el RE. Tcp11l1 es una proteína de función desconocida. El interactoma realizado de Tcp11l1 muestra que es una proteína que interacciona con proteínas del citoesqueleto como tubulina y β-actina. En consecuencia, en relación con el primer objetivo de este tesis, se propone un modelo en el que Rabfilina3A contribuye al transporte de vesículas y de SNAP25 a la membrana plasmática gracias a la interacción con Tcp11l1, posteriormente Rabfilina3A vuelve a su situación de partida gracias a STIM1. Los resultados del segundo objetivo sugieren que el borde del bolsillo de unión a DAG del dominio C1B de PKCε es fuertemente electropositivo permitiendo su unión a PA. La activación de PKCε por PA junto con el Ca2+ desencadena un incremento de la fusión de vesículas en mastocitos. Este hallazgo se correlaciona con el aumento de la fosforilación de SNAP23 en respuesta a la interacción de PKCε con PA. Por tanto, se sugiere un modelo en el que PKCε es activada por PA y fosforila a SNAP23 facilitando la fusión de vesículas.
Embargo
Betalaínas con actividad frente a Alzheimer y cáncer : bioprospección, diversificación estructural y caracterización funcional
(Universidad de Murcia, 2026-04-28) Martínez Rodríguez, Pedro; Gandía Herrero, Fernando; Guerrero Rubio, María Alejandra; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
La presente Tesis Doctoral abordó de manera integral el estudio de las betalaínas, superando las limitaciones impuestas por el uso habitual de extractos complejos de fuentes convencionales como Beta vulgaris y Opuntia ficus-indica. La investigación exploró desde el origen y la presencia de pigmentos hasta ahora no considerados en la naturaleza hasta su potencial terapéutico en enfermedades de alto impacto como el Alzheimer y el cáncer. Así, la Tesis se estructuró en tres ejes principales: la bioprospección de betalaínas singulares, la modificación estructural del ácido betalámico para la obtención de nuevas familias de pigmentos a partir de sustratos no convencionales, y la caracterización funcional de la bioactividad de moléculas individuales tanto in vitro como in vivo utilizando el modelo animal Caenorhabditis elegans. La investigación comenzó expandiendo las fronteras conocidas de estos pigmentos, documentando por primera vez la amplia distribución (29 compuestos identificados) de betalaínas descarboxiladas, derivadas de la dopamina, en especies de la familia Amaranthaceae, especialmente en la quinoa (Chenopodium quinoa), consolidándolas como una familia de fitoquímicos relevante para la fisiología de estas plantas. Asimismo, se exploró la biosíntesis de betalaínas en el hongo "fósil viviente" Neolecta irregularis. Mediante la caracterización de su enzima 4,5-DOPA-extradiol-dioxigenasa (NiDODA), se demostró la capacidad formadora de betalaínas en este ascomiceto basal, expandiendo así la distribución filogenética de esta ruta biosintética fuera del reino vegetal. Por otro lado, se llevó a cabo la modificación química de la unidad estructural y funcional de las betalaínas: el ácido betalámico. En este ámbito, se describió la síntesis y caracterización de una nueva familia de betalaínas metiladas mediante la incorporación de un grupo metilo para formar el ácido 6-metil-betalámico. Además, se sintetizaron betalaínas hidroxiladas utilizando como molécula precursora la noradrenalina, resultando en pigmentos con mayor polaridad. Así, la investigación llevada a cabo representa el inicio de la era de la química del núcleo central de las betalaínas, abriendo una vía para el diseño de nuevos pigmentos bioactivos hechos a medida. Asimismo, se evaluó la actividad biológica de estos pigmentos utilizando el modelo animal Caenorhabditis elegans. Respecto a la enfermedad de Alzheimer, se demostró que las betalaínas poseen propiedades anti-amiloidogénicas; 22 moléculas redujeron la agregación del péptido amiloide in vitro, y los ensayos in vivo confirmaron una mejora significativa en el comportamiento quimiotáctico en estirpes de C. elegans que son modelo de Alzheimer, respaldada además por estudios de docking molecular. En cuanto a la actividad antitumoral, las betalaínas metiladas mostraron una potente capacidad para reducir la proliferación de células tumorales en C. elegans. Entre ellas, la prolina-6-metil-betaxantina destacó como el pigmento más efectivo, logrando reducir el tamaño tumoral en un 48,4 %. Como estrategia para trasladar estos hallazgos a una aplicación real, se desarrollaron liposomas cargados con betalaínas que garantizan su biodisponibilidad. Estos sistemas no solo preservaron las propiedades antioxidantes de los pigmentos, sino que liposomas cargados con betalaínas aumentaron la vida media de C. elegans hasta en un 21,8 %, demostrando ser un sistema eficaz de administración. En conjunto, esta Tesis posiciona a las betalaínas, tanto tradicionales como modificadas estructuralmente, como candidatas prometedoras para el desarrollo de nutracéuticos y agentes farmacológicos. Los resultados obtenidos proporcionan una base sólida que va desde la caracterización más básica hasta la evidencia preclínica, destacando el papel de las betalaínas como potenciales moléculas de interés en la lucha contra enfermedades neurodegenerativas y oncológicas.
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Biología molecular de las membranas celulares : ciencia básica y derivaciones aplicadas : lección inaugural del curso académico 1994-1995
(1994) Gómez Fernández, Juan Carmelo
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Biomarcadores celulares, moleculares y genéticos de linfocitos B para el rechazo y tolerancia del aloinjerto renal
(Universidad de Murcia, 2021-03-29) Alfaro González, Rafael; Muro Amador, Manuel; Escuela Internacional de Doctorado
OBJETIVOS: El objetivo general de la tesis es evaluar si los procesos que median el rechazo y tolerancia al aloinjerto renal están reguladores por diferentes biomarcadores genéticos, moleculares y celulares de linfocitos B. Para ello, se abordaran los siguientes objetivos específicos: 1) Monitorizar subpoblaciones de linfocitos B y evaluar su utilidad pronóstico para el post-trasplante. 2) Estudiar polimorfismos funcionales y cuantificar los niveles de moléculas del sistema BAFF para, posteriormente, correlacionar con la evolución del trasplante y la producción de anticuerpos anti-HLA específicos frente al donante. 3) Estudiar miARN implicados en el desarrollo y activación de linfocitos y establecer su relación con el rechazo agudo del injerto. 4) Búsqueda de biomarcadores y desarrollo de modelos diagnósticos de rechazo mediado por anticuerpos mediante técnicas bioinformáticas. METODOLOGÍA: En la presente tesis se incluyeron muestras de pacientes sometidos a trasplante renal realizados entre el año 2013 y el 2018 en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de Murcia. La monitorización de subpoblaciones de linfocitos B se realizó mediante citometría de flujo. Los polimorfismos y la expresión génica de moléculas del sistema BAFF y de miARN se estudiaron mediante PCR cuantitativa, y las formas solubles mediante ELISA. Por último, se realizó un meta-análisis con estudios de la base de datos GEO y se emplearon diferentes aplicaciones bioinformáticas (xCell, Gene2Drug etc.) para el análisis de los datos. CONCLUSIONES: 1) Los perfiles inmunológicos basados en subpoblaciones de linfocitos B (LB) permiten agrupar a los trasplantados renales según el diferente riesgo de rechazo agudo. Los trasplantados que presentan niveles disminuidos de LB transicionales y plasmablastos se asocian a una peor función renal y mayor incidencia de rechazo agudo durante el primer año post-trasplante. Además, la elevación de LB transicionales durante el post-trasplante se asocia con un aumento de los linfocitos T reguladores en el mismo periodo, por tanto, la elevación de subpoblaciones de carácter inmunosupresor parece ejercer un efecto protector frente al rechazo del injerto. 2) El estudio de biomarcadores del sistema BAFF, muestra que el polimorfismo rs3803800 del gen TNFSF13, que codifica para APRIL, modifica el riesgo de sufrir rechazo agudo. Los análisis bioinformáticos sugieren que este polimorfismo podría alterar la regulación del splicing y de esta manera repercutir en los niveles de expresión de APRIL. Además, los niveles séricos de APRIL aumentan durante el rechazo agudo, por lo tanto, su cuantificación podría ser empleada para el diagnóstico no invasivo de rechazo. Por otra parte, la elevación de la expresión génica de los receptores R-BAFF y TACI se asocia con un mayor riesgo de desarrollo de anticuerpos anti-HLA donante específicos. 3) Los niveles de expresión de miR-150-5p están disminuidos en trasplantados renales con rechazo agudo. Los análisis bioinformáticos de los genes diana de miR-150-5p sugieren que la sobre-expresión de MBD6 y de genes de la vía de señalización del receptor EGF, podrían estar involucrados en la desregulación de la expresión de genes implicados en el rechazo agudo. 4) Los análisis bioinformáticos muestran la importancia de la vía de señalización IRF/STAT1 de respuesta a interferones durante el rechazo mediado por anticuerpos (RMA). A nivel celular, la infiltración de linfocitos NK y monocitos en el aloinjerto, así como el aumento de la maduración de células dendríticas, ejercen un papel central en la mediación del daño que sufre el injerto durante el RMA. Los modelos basados en algoritmos TSP muestran una alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico no invasivo del RMA, que junto con el bajo coste y facilidad de interpretación, hace de los modelos TSP idóneos para su utilización en laboratorios clínicos de rutina.
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Biosynthesis, production and biological activity of singular betalain pigments
(Universidad de Murcia, 2022-07-13) Henarejos Escudero, Paula; Gandía Herrero, Fernando; García Carmona, Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
Tradicionalmente se ha considerado que la unidad estructural que compartían todas las betalaínas era el ácido betalámico, el cual se obtiene tras la ciclación espontánea de 4,5-seco-DOPA, molécula resultante de la acción de la enzima 4,5-DOPA-extradiol-dioxigenasa (DODA) sobre el aminoácido aromático L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Sin embargo, los trabajos realizados en esta Tesis Doctoral cambian este paradigma, mostrando una nueva unidad estructural y descubriendo fuentes alternativas de pigmentos betalámicos singulares. Los objetivos de esta Tesis fueron: 1- Búsqueda de fuentes alternativas de betalaínas en plantas. 2- Caracterización fisicoquímica de nuevas betalaínas y estudio de sus rutas biosintéticas. 3- Desarrollo de procesos biotecnológicos para la producción de betalaínas, tanto con estrategias microbiológicas como de origen vegetal. 4- Caracterización del potencial promotor de la salud de betalaínas singulares en el modelo animal Caenorhabditis elegans. En la búsqueda de nuevas fuentes de betalaínas, los pigmentos de Dionaea muscipula Ellis, también conocida como Venus atrapamoscas, fueron estudiados. El establecimiento inequívoco de antocianinas en D. muscipula apoya la exclusión de la familia Droseraceae del orden Caryophyllales desde un punto de vista fitoquímico y su inclusión en el orden Nepenthales. Se han establecido las condiciones para el desarrollo de líneas de callos de Chenopodium quinoa en medio sólido que producen diferentes betalaínas. Indicando que el aumento de la hormona 6-benzilaminopurina y la disminución de nitrógeno en el medio de cultivo son factores clave para activar la ruta biosintética de las betalaínas. La detección de dos betaxantinas derivadas de dopamina en granos de quinua abrió la posibilidad de la existencia de múltiples pigmentos derivados de dopamina en la naturaleza. Probablemente ocultos como compuestos menores en los registros de HPLC de plantas. Se ha descrito una nueva ruta biosintética capaz de producir betalaínas descarboxiladas in planta, como se ha demostrado en C. quinoa. La enzima clave en la ruta derivada de dopamina es una 4,5-extradiol-dioxigenasa (DODA) que escinde el anillo de esta amina, y que se ha caracterizado a nivel cinético y molecular. La proteína es una enzima dual y expresa actividad frente a los sustratos de relevancia fisiológica, L-DOPA y dopamina. Con la sola expresión de la enzima DODA, se reprodujo biotecnológicamente el perfil de betalaínas presentes de forma natural en los granos de quinua. Esto se considera una clara demostración de la simplicidad de la ruta biosintética, propuesta con forma cuadrada, necesaria para producir los pigmentos. Se ha descubierto, descrito y caracterizado toda una nueva familia de betalaínas, las 6-descarboxibetalaínas. Todos los miembros caracterizados presentan propiedades de color similares y una fuerte fluorescencia. Sin embargo, las doce betalaínas descarboxiladas estudiadas en esta Tesis presentan diferentes comportamientos in vivo en ensayos de capacidad antioxidante y promotora de la salud en el animal modelo Caenorhabditis elegans. Además, se ha estudiado el potencial de las 6-descarboxibetalínas como moléculas antiagregantes de β-amiloide in vitro. Cuatro betalaínas descarboxiladas han mostrado resultados prometedores con valores IC50 en el rango micromolar, de posible interés en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer. También se ha estudiado como betalaínas carboxiladas tradicionales y extractos naturales reducen el crecimiento tumoral in vivo y amplían la vida media del modelo tumoral de Caenorhabditis elegans (gld-1). La molécula más eficaz en la reducción del tamaño tumoral es la L-triptófano-betaxantina. Las betalaínas actúan no solo como antioxidantes, sino también regulando el factor de transcripción DAF-16. Así, las betalaínas se revelan como potenciales fitoquímicos anticancerígenos, de posible importancia en las estrategias de quimioprevención y tratamiento. Profundizando en esta actividad, se han diseñado nuevas betaxantinas que parten de L-triptófano-betaxantina como molécula líder. Los nuevos pigmentos se han producido biotecnológicamente y se han caracterizado sus propiedades. Todos estos nuevos pigmentos muestran una reducción significativa del tamaño de las gónadas tumorales en C. elegans (gld-1).
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Biotechnological Synthesis and Molecular Encapsulation of Natural Stilbenes and Lipophilic Derivatives for Biomedical and Food Applications
(Universidad de Murcia, 2024-07-15) Navarro Orcajada, Silvia; Matencio Durán, Adrián; López Nicolás, José Manuel; Escuela Internacional de Doctorado
Los estilbenos son compuestos fenólicos con numerosas bioactividades que los hacen de interés para la salud humana, como su actividad antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatoria, cardioprotectora, anticancerígena o anti-obesidad. Se trata de metabolitos secundarios producidos por determinadas plantas para protegerlas frente a situaciones de estrés biótico o abiótico, siendo la enzima estilbeno sintasa clave en este proceso de biosíntesis. Dentro de este grupo de compuestos bioactivos, destaca el resveratrol por ser el más investigado, sin embargo, existen otros estilbenos menos conocidos con mayor actividad. No obstante, la limitada producción, baja solubilidad en agua, facilidad para degradarse, así como baja biodisponibilidad de esta familia de compuestos bioactivos dificultan su correcta aplicación en la industria alimentaria, cosmética o farmacéutica. En esta Tesis Doctoral se han investigado varias estrategias con el objetivo de hacer frente a estas limitaciones mediante el empleo de diversas metodologías. Con el fin de abordar los problemas en la obtención de estilbenos naturales, se ha desarrollado un método para aumentar la síntesis enzimática de piceatanol y se ha optimizado la expresión de una nueva proteína estilbeno sintasa recombinante encontrada mediante análisis filogenéticos, los cuales también permitieron descubrir el origen y la evolución de estas proteínas en distintos reinos. Además, se caracterizaron y encapsularon algunos de los análogos del resveratrol más prometedores, logrando incrementar su solubilidad y estabilidad en disoluciones acuosas mediante complejos de inclusión con ciclodextrinas, determinando la estequiometria y las constantes de encapsulación, así como el tipo de ciclodextrina que formaba los complejos más estables. Por otra parte, para hacer frente a los problemas de biodisponibilidad de los estilbenos, se sintetizaron derivados hidrofóbicos de estilbenos que podrían actuar como precursores de estos para vehiculizarlos mejor a los tejidos diana. Los procesos de síntesis optimizados lograron rendimientos elevados con alta especificidad. Los derivados obtenidos fueron caracterizados fisicoquímicamente y encapsulados en ciclodextrinas para después analizar sus propiedades biológicas in vitro e in vivo. Se pudo observar que los derivados hidrofóbicos de estilbenos podían ser susceptibles de ser hidrolizados durante el proceso digestivo. No obstante, el uso de inhibidores contrarrestó eficazmente esta hidrólisis, ayudando a su mejor conservación. El efecto de la adición de agentes encapsulantes en este proceso también fue evaluado, caracterizando los complejos formados. En general, los derivados hidrofóbicos de estilbenos fueron más estables, menos metabolizables y más permeables que sus estilbenos originales, respaldando la modificación estructural de estilbenos. También se descubrió que las ciclodextrinas interfieren con los métodos de determinación de actividad antioxidante in vitro, pudiendo dar lugar a malinterpretaciones de actividad en su presencia. Esta interferencia parece estar causada por la encapsulación de los reactivos implicados en las reacciones. Por otra parte, se establecieron relaciones estructura-actividad entre la actividad citotóxica de varios análogos del resveratrol, permitiendo seleccionar aquellos estilbenos con un mayor potencial terapéutico. Los estudios in vivo con los derivados hidrofóbicos de estilbenos libres y/o encapsulados mostraron efectos beneficiosos sobre la obesidad y el cáncer, sin llegar a observarse efectos nocivos en los individuos tras su administración. Finalmente, se desarrollaron modelos de alimentos funcionales enriquecidos con uno de estos derivados, en su forma libre y encapsulada, monitorizando los parámetros de calidad y estabilidad del ingrediente bioactivo en distintas condiciones de almacenamiento, con el fin de evaluar la viabilidad de su aplicación en industria. En general, los resultados de esta Tesis Doctoral presentan distintos enfoques innovadores para abordar la problemática actual que restringe el uso de estilbenos, consiguiendo aumentar su producción, caracterización, solubilidad, estabilidad y biodisponibilidad, para poder ser utilizados de manera eficaz en biomedicina y en alimentación.
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Búsqueda de nuevas opciones terapéuticas para el tratamiento de la endometriosis
(Universidad de Murcia, 2026-05-25) García Izquierdo, Mª Laura; Martínez-Esparza Alvargonzález, María Concepción; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
La endometriosis es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta aproximadamente al diez por ciento de las mujeres en edad reproductiva y se asocia a dolor pélvico persistente e infertilidad, con un impacto significativo en la calidad de vida. Las opciones terapéuticas actuales se basan principalmente en tratamientos hormonales y cirugía, con eficacia variable, riesgo de recurrencia y limitaciones derivadas de efectos secundarios o del deseo gestacional. Estas circunstancias ponen de manifiesto la necesidad de nuevas aproximaciones dirigidas a los mecanismos fisiopatológicos implicados en la enfermedad. En los últimos años, se ha consolidado la consideración de la endometriosis como una patología inflamatoria compleja en la que la alteración del sistema inmunitario innato desempeña un papel relevante. En particular, los macrófagos peritoneales y su interacción con las células endometriales contribuyen al mantenimiento de un microambiente inflamatorio persistente asociado a la progresión de las lesiones y al dolor. El objetivo general de esta tesis fue integrar el análisis crítico de la evidencia terapéutica disponible para el tratamiento del dolor asociado a la endometriosis con la evaluación preclínica de estrategias no hormonales basadas en la modulación de la respuesta inflamatoria innata. Para ello, se llevó a cabo una revisión estructurada de las opciones terapéuticas actuales y de las alternativas emergentes, así como estudios experimentales in vitro empleando modelos celulares humanos para analizar la activación funcional de macrófagos y su interacción con células endometriales. Los resultados obtenidos respaldan la relevancia de los mecanismos inmunológicos en la fisiopatología de la endometriosis y apoyan la exploración de estrategias no hormonales orientadas a la modulación de la inflamación como aproximación terapéutica potencial.
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Caracterizació molecular y funcional de Gbp4 de pez cebra : un nuevo componente del inflamasoma= Molecular and functional chraterization of zebrafish Gbp4: a new inflammasome component
(2015-09-08) Tyrkalska, Sylwia Dominika; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
INTRODUCCIÓN: La señalización a través de los NOD-like receptors (NLRs), que son una familia de receptores citosólicos de reconocimiento de patrones (PRRs), da lugar al procesamiento y activación de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1 β e IL-18 mediados por caspasa-1, así como de la inducción de una forma de muerte celular recientemente descrita llamada piroptosis. Para ello, los NLRs median la formación de plataformas multiproteicas de señalización llamadas inflamasomas, que alertan al sistema inmune de la presencia de infección o daño tisular. OBJETIVOS: (1) Establecimiento de un modelo de infección de Salmonella Typhimurium en pez cebra para estudiar la activación, el ensamblaje y el funcionamiento del inflamasoma; (2) Caracterización del papel de la flagelina de S. Typhimurium en el mecanismo de infección en pez cebra; (3) Caracterización del papel de Gbp4 de pez cebra en la activación y ensamblaje del inflamasoma, así como en la eliminación de S. Typhimurium; (4) Caracterización del papel de los neutrófilos en la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 en pez cebra; (5) Caracterización del papel de Gbp4 en la producción de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, y del de las prostaglandinas en la eliminación de S. Typhimurium. METODOLOGÍA: Los métodos utilizados en la tesis doctoral son: Ensayos de infección con S. Typhimurium, ensayos de actividad caspasa-1, toma de imágenes de larvas de pez cebra, reclutamiento de neutrófilos y análisis de la muerte celular, ensayos de luminescencia, citometría de flujo, análisis de expresión génica, Western blot, ensayo de reconstitución del inflamasoma en células HEK293. RESULTADOS: Aquí demostramos que la proteína Gbp4 de pez cebra, una enzima GTPasa inducible por IFNγ que alberga un dominio C-terminal CARD, se expresa en los neutrófilos y es necesaria para la eliminación de Salmonella Typhimurium in vivo dependiente del inflamasoma. A pesar de la presencia del dominio CARD, Gbp4 requiere la presencia de la proteína adaptadora Asc para desempeñar su función antibacteriana. Además, la actividad GTPasa de Gbp4 es indispensable para la activación del inflamasoma, el reclutamiento de neutrófilos al lugar de la infección, y la eliminación de S. Typhimurium. La reconstitución de los complejos Gbp4-Asc en células embrionarias humanas de riñón (HEK293) en cultivo, nos mostró que forman complejos macromoleculares con un anillo exterior de Asc y un núcleo de Gbp4. Mecanísticamente, Gbp4 es esencial para la liberación de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, de las cuales PGD2 se asocia con la eliminación de bacterias mediada por Gbp4. Por tanto, nuestros resultados señalan a las proteínas de unión con GTPasa como los adaptadores clave del inflamasoma necesarios para la biosíntesis de prostaglandinas y la eliminación de bacterias intracelulares por los neutrófilos in vivo. CONCLUSIONES: (1) El pez cebra es un excelente modelo para estudiar la activación y la función del inflamasoma en respuesta a una infección por S. Typhimurium; (2) El reconocimiento intracelular de S. Typhimurium en pez cebra depende altamente de la producción de flagelina; (3) La activación del inflamasoma dependiente de Gbp4 mejora la resistencia de las larvas de pez cebra e incrementa la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium; (4) Tanto Gbp4 mutante que carece de la actividad GTPasa, como el doble mutante al que también le falta el dominio CARD, se comportan como dominantes negativos, incrementando la susceptibilidad a S. Typhimurium y, en paralelo, reduciendo la actividad caspasa-1; (5) El mutante de Gbp4 sin el dominio CARD actúa, al igual que GBP5 de mamíferos, rescatando la elevada susceptibilidad de las larvas deficientes en Gbp4, pero no aumenta la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium en pez cebra; (6) Gbp4 regula el reclutamiento de neutrófilos al lugar de infección y, además, la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 esta mediada por los neutrófilos; (7) El inflamasoma dependiente de Gbp4 activa la biosíntesis de las prostaglandinas, que a su vez fomentan la eliminación de S. Typhimurium. INTRODUCTION: The nucleotide-binding domain leucine-rich repeats (NLRs) constitute a family of cytosolic pattern recognition receptors (PRRs), which are the responsible for the caspase-1-mediated processing and activation of pro-inflammatory cytokines, such us IL-1 β and IL-18, and the induction of a recently described form of cell death called pyroptosis. NLRs achieve these functions by forming multiprotein signaling platforms, called inflammasomes, which alert the immune system about the presence of infection or tissue damage. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Establishment of a zebrafish – Salmonella Typhimurium infection model to study inflammasome activation, assembly and function; (2) Characterization of the role of flagellin of S. Typhimurium in the infection mechanism in zebrafish; (3) Characterization of the role of zebrafish Gbp4 in inflammasome activation, assembly and clearance of S. Typhimurium; (4) Characterization of the role of neutrophils in the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium in zebrafish; (5) Characterization of the role played by the Gbp4 inflammasome in prostaglandin production and S. Typhimurium clearance. METHODOLOGY: The following methods were used in this doctoral thesis: yolk sac or ear infection assays with S. Typhimurium, caspase-1 activity assays of infected larvae, counting of neutrophils using different zebrafish transgenic lines with fluorescent neutrophils using live imaging, neutrophil recruitment assays, cell death analysis, luminescence assays for the measurement of Il1-β contents, flow cytometry and FACS-sorting of fluorescent cells, gene expression analysis, western blot, inflammasome reconstitution assays in HEK293 cells. RESULTS: Here we report that zebrafish Gbp4, an IFNγ-inducible GTPase harboring a C-terminal CARD domain, is expressed in neutrophils and is required for the inflammasome-dependent clearance of Salmonella Typhimurium in vivo. Despite the presence of the CARD domain, Gbp4 requires the universal inflammasome adaptor protein Asc for mediating its antibacterial function. In addition, the GTPase activity of Gbp4 is indispensable for the inflammasome activation, the neutrophil recruitment and the clearance of S. Typhimurium. Reconstitution of Gbp4-Asc complexes in human embryonic kidney cells (HEK293) revealed a macromolecular complex with an outer ring of Asc and an core of Gbp4. Mechanistically, Gbp4 is essential for the inflammasome-dependent release of prostaglandins, of which PGD2 is associated with the Gbp4-mediated bacterial clearance. Our results, therefore, point to GTPase-binding proteins as the key inflammasome adaptors required for prostaglandin biosynthesis and intracellular bacterial clearance by neutrophils in vivo. CONCLUSIONS: The above results suggest that: (1) Zebrafish is an excellent model to study inflammasome activation and function upon S. Typhimurium infection; (2) Intracellular recognition of S. Typhimurium in zebrafish highly depends on flagellin production; (3) Gbp4-dependent inflammasome activation improves zebrafish larvae resistance and increases caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection; (4) A Gbp4 mutant lacking GTPase activity, as well as a double GTPase and CARD mutant, behave as dominant negatives by increasing the susceptibility to S. Typhimurium and, in parallel, decreasing caspase-1 activity; (5) A Gbp4 mutant lacking the CARD domain acts as mammalian GBP5; that is, rescues the higher susceptibility of Gbp4-deficient larvae but fails to increase caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection in zebrafish; (6) Gbp4 regulates neutrophil recruitment to the site of the infection. In addition, the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium is mediated by neutrophils; (7) The Gbp4-dependent inflammasome activates prostaglandin biosynthesis, which in turn promotes S. Typhimurium clearance.
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Caracterización de la biosíntesis de melaninas en vibrio cholerae /Carolina Ruzafa López ; Francisco Solano Muñoz y Antonio Sánchez Amat, directores.
(Murcia : Universidad,, 1994) Ruzafa López, Carolina; Solano Muñoz, Francisco; Sánchez Amat, Antonio
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Caracterización de las rutas de MAP Quinasas de respuesta a estrés e integridad celular, y su interacción funcional con otras vías de señalización intracelular en Schizosaccharomyces pombe
(Universidad de Murcia, 2018-02-26) Vázquez Marín, Beatriz; Cansado Vizoso, José; Madrid Mateo, María Isabel; Facultad de Biología
Las proteínas quinasas C (PKCs) juegan un papel esencial durante la regulación de numerosos procesos fisiológicos en los organismos eucariotas. La levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe posee dos ortólogos a PKC, Pck1 y Pck2, que actúan aguas arriba del módulo de MAP quinasas de integridad celular regulando la morfogénesis y la biosíntesis de la pared celular. Los resultados revelaron que, pese a su fuerte similitud estructural y redundancia funcional, los mecanismos que regulan la maduración, activación y estabilización de ambas quinasas tienen un impacto biológico notablemente distinto. Así, la fosforilación in vivo de Pck1 en el bucle de activación y en los motivos de giro e hidrofóbico es esencial para su estabilidad y funciones biológicas. Por el contrario, Pck2 es parcialmente funcional independientemente de su actividad catalítica. Sorprendentemente, la activación constitutiva promueve la desfosforilación y la desestabilización de Pck2, mientras que aumenta los niveles de Pck1, lo que provoca un fenómeno de interferencia de la señalización aguas abajo hacia la ruta de integridad celular dependiente de Pck2. Estos resultados indican que la evolución temprana a partir de un antepasado común implicó cambios importantes en los mecanismos que regulan la activación catalítica y la estabilidad de los miembros de la familia PKC, lo que permitiría un control flexible de sus funciones biológicas, incluyendo señalización por rutas de MAP quinasas. Las rutas TOR desempeñan un papel clave en el control del crecimiento y envejecimiento celular, y su disfunción provoca enfermedades como el cáncer, obesidad y diabetes. Hemos utilizado un enfoque multidisciplinar que combina técnicas genéticas, bioquímicas, y de biología celular, con el fin de estudiar las interacciones funcionales de las rutas de integridad celular (CIP) y TOR durante el control del crecimiento y la respuesta celular frente al estrés. Nuestros resultados sugieren que Rhy1, la GTPasa activadora del complejo TORC2 en S. pombe, activa la ruta CIP mediante dos mecanismos distintos. El primero incluye a los complejos TORC2-Gad8 y TORC1-Psk1, que promueven la síntesis de Pck2 en respuesta al estrés inducido por daño en la pared celular o tras el ayuno de glucosa. En el segundo mecanismo Ryh1 activa a la MAPK Pmk1 de forma independiente de TORC2, regulando la localización y/o tráfico en la membrana plasmática de activadores de la ruta como la PDK Ksg1 y el GEF Rgf1. Por último, Pmk1 actúa aguas arriba de Ryh1 para inhibir la señalización de TORC2 en respuesta a estrés. La coordinación de las rutas TOR y de MAP quinasas de integridad celular por medio de activaciones e inhibiciones cruzadas permitirían modular de manera precisa la adaptación y supervivencia celulares frente a múltiples situaciones ambientales. A diferencia del resto de proteínas quinasas, la activación catalítica de las MAP implica la fosforilación dual en dos residuos de tirosina y treonina del motivo conservado -TXY-. Se ha empleado S. pombe como modelo para analizar la posible relevancia biológica de las formas monofosforilables de MAP quinasas Pmk1 y Sty1 (ruta de respuesta a estrés). Nuestros resultados sugieren que ambas quinasas se fosforilan mediante un mecanismo secuencial de tipo “procesivo” en el que la fosforilación en tirosina es un pre-requisito para la fosforilación en el residuo de treonina tanto en condiciones basales como en respuesta a estrés. De hecho, la imposibilidad de fosforilación de Sty1 y Pmk1 en el residuo de treonina del bucle de activación provoca la unión constitutiva entre MAPKK y MAPK, con la consiguiente hiperfosforilación en el residuo de tirosina. Las formas monofosforiladas en treonina de las MAP quinasas Sty1 y Pmk1 son funcionales in vivo, aunque de forma parcial, siendo capaces de promover una respuesta adaptativa moderada frente a estrés. Protein kinase C (PKC) family of enzymes play an essential role in the regulation of numerous physiological processes in eukaryotic organisms. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe has two PKC orthologs, Pck1 and Pck2, which act upstream of the cell integrity MAP kinase pathway (CIP) to regulate morphogenesis and cell wall biosynthesis. We found that, despite their strong structural similarity and functional redundancy, the mechanisms regulating maturation, activation and stabilization of both kinases have a remarkably distinct biological impact. Thus, in vivo phosphorylation of Pck1 within activation loop, turn and hydrophobic motifs is essential for its stability and biological functions. In contrast, Pck2 is partially functional independent of its catalytic activity. Remarkably, constitutive activation promotes dephosphorylation and destabilization of Pck2, while it enhanced Pck1 levels, which interferes with proper downstream signalling to the CIP triggered by Pck2. These results suggest that early duplication from a common ancestor involved significant changes in the mechanisms regulating catalytic activation and stability of the PKC family members, which would allow a flexible control of their biological functions, including MAP kinase signalling. TOR plays a key role in controlling cell growth and aging, and its dysfunction causes diseases such as cancer, obesity, and diabetes. We used a multidisciplinary approach combining genetic, biochemical and cell biology techniques to study the functional interactions between the CIP and TOR pathways during cell growth and in response to stress. Our results revealed that Rhy1, the GTPase activator of the TORC2 complex in S. pombe, activates the CIP by two distinct mechanisms. The first one includes the TORC2-Gad8 and TORC1-Psk1 complexes, which promote the synthesis of Pck2 in response to stress induced by cell wall damage or glucose starvation. In the second mechanism, Ryh1 activates the MAPK Pmk1 independently of TORC2, regulating the localization and/or traffic at the plasma membrane of upstream activators of the MAPK cascade including PDK-1 ortholog Ksg1 and GEF Rgf1. Finally, activated Pmk1 acts upstream of Ryh1 to inhibit TORC2 signalling in response to stress. Coordinated regulation of TOR and CIP pathways through cross-activation and inhibitory mechanisms would allow to accurately modulate cell adaptation and survival against different environmental insults. Unlike the other protein kinases, catalytic activation of the MAPKs depends on dual phosphorylation at two tyrosine and threonine residues within the conserved -TXY- motif. We have employed S. pombe as a model organism to analyze the possible biological relevance of monophosphorylated forms of MAP kinases Pmk1 and Sty1 (stress response pathway). Our results suggest that both kinases are phosphorylated by a "processive" sequential mechanism in which tyrosine phosphorylation is a pre-requisite to further phosphorylation at the threonine residue during growth and stress. In fact, the inability of phosphorylation of both Sty1 and Pmk1 at the threonine residue within the activation loop elicited the constitutive binding between MAPKK and MAPK and subsequent hyperphosphorylation at the tyrosine residue. Threonine monophosphorylated forms of the MAP kinases Sty1 and Pmk1 are partially functional in vivo and promote a moderate adaptive response to stress.