Browsing by Subject "Biofísica"

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    Interacción de los fármacos antineoplásicos tamoxifeno y 4-hidroxitamoxifeno con membranas fosfolipídicas
    (Universidad de Murcia, 2023-05-30) Ortiz Martínez, Julia; Ortiz López, Antonio; Escuela Internacional de Doctorado
    Objetivos Dada la elevada naturaleza lipofílica de los fármacos antineoplásicos tamoxifeno (TMX) y 4 hidroxitamoxifeno (HTMX), de amplia utilización en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama ER-positivos, el objetivo general de esta tesis es profundizar en el efecto de dichas sustancias sobre la estructura y funcionalidad de las membranas fosfolipídicas. Esto se traduce en los siguientes objetivos específicos: - Estudiar la interacción de TMX y HTMX con membranas fosfolipídicas modelo compuestas del fosfolípido 1,2 dipalmitilfosfatidilcolina (DPPC). - Analizar la influencia de TMX y HTMX sobre la estructura y funcionalidad de sistemas compuestos por el fosfolípido 1,2 dielaidilfosfatidiletanolamina (DEPE). - Caracterizar el mecanismo molecular de la permeabilización de membranas fosfolipídicas modelo de distinta composición, por TMX y HTMX. Metodología En estos estudios se ha seguido fundamentalmente una aproximación biofísica, utilizando técnicas experimentales y simulaciones por dinámica molecular (MD) de amplio uso en este campo. Las técnicas experimentales son las siguientes. - Como modelos de membrana se han usado vesículas multilamelares (MLV) y vesículas unilamelares grandes (LUV). Las MLV se han preparado por el método de hidratación de películas finas, y las LUV por el método de extrusión a través de filtros de policarbonato. - Calorimetría diferencial de barrido (DSC), que permite analizar el efecto de los fármacos bajo estudio sobre el comportamiento termotrópico de fase de los fosfolípidos. A partir de los termogramas obtenidos se han elaborado diagramas parciales de fase para el componente lipídico, que han permitido analizar la influencia de estos compuestos sobre el comportamiento de fase de los distintos fosfolípidos, a saber DPPC, DEPE, y otros. - Espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR), que ha aportado información sobre la interacción droga-fosfolípido a partir del efecto sobre bandas de absorción características tanto de la cabeza polar (fosfato, carbonilo), como de las cadenas acílicas (metileno, metilo terminal). El equipo disponible ha permitido realizar barridos de temperatura y analizar estas interacciones tanto en fase gel, como en fase líquido-cristalina. - Difracción de rayos X, que permite medidas tanto en el ángulo estrecho como en el ángulo ancho. Con este equipo se han obtenido los perfiles de densidad electrónica de los fosfolípidos en ausencia y presencia de TMX y HTMX, analizando su efecto sobre el grosor de la bicapa, la organización de las cadenas acílicas, y el polimorfismo lipídico (formación de fases no lamelares, como la fase hexagonal invertida-HII). - Espectroscopía de fluorescencia. Esta técnica se ha usado en primer lugar para monitorizar el efecto de TMX y HTMX sobre la fluidez de la membrana, usando sondas fluorescentes como el DPH y el TMA-DPH. En segundo lugar, para analizar cuantitativamente la permeabilización de bicapas por TMX y HTMX. Para este fin se ha usado un ensayo de fluorescencia basado en la liberación de la sonda fluorescente carboxifluoresceína encapsulada en el compartimento acuoso de LUV. - Como complemento a los estudios experimentales, se ha llevado a cabo simulaciones de MD. En este tipo de simulaciones se ha construido una bicapa lipídica a partir del fosfolípido seleccionado, y se han incorporado los fármacos bajo estudio, a relaciones molares similares a las usadas en los estudios experimentales. Las simulaciones se han realizado con GROMACS, usando parámetros de campo de fuerza CHARMM36. Las estructuras de membrana iniciales se construyeron usando Packmol, y se usaron barridos productivos en torno a 120 ns. Las representaciones gráficas se hicieron con PyMOL. Resultados TMX y HTMX afectan al comportamiento de fase de DPPC, dando lugar a la formación de dominios enriquecidos en el fármaco dentro de la bicapa (separación lateral de fases). Ambos compuestos se localizan en regiones distintas dentro de la membrana. Por otra parte, TMX permeabiliza membranas fluidas, siendo el efecto de HTMX mucho más débil. La MD apoya la tendencia de estos compuestos a formar agregados dentro de la membrana, y localiza al TMX a todo lo largo de la bicapa, mientras que HTMX se localiza más próximo a la interfase lípido/agua. La incorporación de TMX en bicapas de DEPE produce un ensanchamiento progresivo de la transición de fase Lβ/Lα, y disminuye la temperatura de transición. La transición Lβ/Lα presenta múltiples endotermas, indicando una segregación lateral de dominios TMX/DEPE en el plano de la bicapa. TMX y HTMX también ensanchan y desplazan la transición de Lα/hexagonal-HII. A partir de los diagramas de fase se infiere que ambos compuestos facilitan la formación de la fase no lamelar HII. La FTIR muestra que ni el TMX ni el HTMX perturban de modo significativo el estado de hidratación de la bicapa de DEPE. Las simulaciones de MD indican que estos fármacos no afectan el grosor de la membrana, el área/lípido, o la conformación de las moléculas de DEPE. Sí se muestra una localización distinta para ambos compuestos, y una diferente tendencia a la agregación. El TMX provoca la permeabilización de membranas de POPC de modo rápido y extenso, siendo el efecto del HTMX mucho más débil. Las curvas de salida de contenidos liposomales se ajustan a dos componentes, dando dos constantes de velocidad correspondientes a un proceso lento y otro rápido. Es muy interesante el hecho de que la incorporación de fosfatidilglicerol o fosfatidiletanolamina protege a la membrana de la permeabilización inducida por los fármacos, sugiriéndose una explicación a partir de las simulaciones de MD. La FTIR muestra un aumento de confórmeros gauche y una deshidratación de la región polar de la membrana por efecto de TMX y HTMX. Los resultados aportan nueva información que podría explicar algunas de las actividades de estos fármacos no relacionadas con el receptor de estrógenos, o incluso algunos de sus efectos secundarios. Conclusiones - TMX y HTMX se incorporan a membranas fosfolipídicas y forman dominios segregados en el plano de la bicapa. - El TMX se puede localizar a todo lo largo de la bicapa fosfolipídica, mientras que el HTMX se sitúa más próximo a la interfase lípido/agua. - Estos dos fármacos desordenan la zona de las cadenas acílicas, y deshidratan la región de las cabezas polares de los fosfolípidos de la membrana, siendo los efectos del TMX más significativos. - TMX y HTMX pueden regular la curvatura local de la membrana, y así promover la formación de fases no-lamelares. - TMX, y en menor medida HTMX, permeabilizan membranas compuestas de fosfatidilcolina, permitiendo la liberación del contenido acuoso de las vesículas al medio externo. La magnitud de esta acción se correlaciona con la distinta capacidad de formar agregados y la distinta localización de ambos compuestos. - La permeabilización de membranas inducida por estos fármacos está modulada por la composición lipídica. Así, fosfolípidos como el fosfatidilglicerol y la fosfatidiletanolamina estabilizan la membrana frente a la permeabilización. Esto es debido a un aumento de las interacciones electrostáticas en la región de las cabezas polares, y a la posibilidad de formación de enlaces de hidrógeno, lo que se traduce en una membrana más cohesionada. - Nuestros datos pueden aportar una base molecular para algunas de las actividades farmacológicas de TMX y HTMX no relacionadas con el receptor de estrógenos, o incluso explicar alguno de los varios efectos secundarios que presentan.
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    Interacción de un diramnolípido biotensioactivo con membranas fosfolipídicas modelo y membranas biológicas
    (Universidad de Murcia, 2022-06-15) Oliva Marín, Alfonso; Ortiz López, Antonio; Escuela Internacional de Doctorado
    Los ramnolípidos son glicolípidos producidos por la bacteria Gram negativa Pseudomonas aeruginosa formados por la unión de uno o dos anillos de ramnosa a una región hidrofóbica con una o dos cadenas de ácidos grasos, denominándose monoramnolípidos o diramnolípidos (diRL), respectivamente. Estas moléculas son biotensioactivos, compuestos de origen microbiano con estructura anfipática responsable de su actividad superficial sobre las interfases. Los tensioactivos se distinguen por su capacidad de formar diferentes agregados estructurales cuando su concentración en un medio acuoso es elevada, permitiéndoles solubilizar compuestos insolubles. Otras propiedades como su acción emulsionante, estabilizante o antioxidante les otorgan una gran relevancia en diferentes aplicaciones biotecnológicas. Los ramnolípidos son unos de los glicolípidos más estudiados, destacando por presentar actividades biológicas muy interesantes, como su capacidad para inhibir el crecimiento de Bacillus subtilis, eliminar las esporas de varias especies de tres géneros de patógenos de plantas o su capacidad para la inhibir del crecimiento del hongo dimórfico Mucor circinelloides. Con el objetivo de caracterizar los procesos fisicoquímicos responsables de estas actividades diversos estudios han abordado el estudio de la interacción entre ramnolípidos y diferentes membranas biológicas y membranas modelo, proteínas, el remodelado lipídico de la membrana, la permeabilización de membranas, o la formación de liposomas dependientes de pH, entre otros. Por otro lado, varios trabajos han estudiado previamente el comportamiento agregacional de los ramnolípidos en agua, describiendo numerosas estructuras entre las que se incluyen micelas, y varios tipos de vesículas o membranas empaquetadas, indicando que los ramnolípidos pueden formar agregados lamelares, vesiculares o micelares en una forma pH-dependiente. Dada la experiencia de nuestro grupo de investigación en la caracterización de la interacción de ramnolípidos con fosfolípidos de membrana y proteínas, así como en el estudio del comportamiento agregacional de los ramnolípidos en medio acuoso, nos planteamos realizar un trabajo enfocado a ampliar el conocimiento en estas líneas de investigación. En el primer trabajo, se ha caracterizado el comportamiento de fases de mezclas de una especie sintética de fosfatidilserina, 1,2-dimiristil fosfatidilserina (DMPS) con un diramnolípido biotensioactivo producido por P. aeruginosa. Se ha observado que concentraciones crecientes de diRL provocan un incremento progresivo en la temperatura de la transición de fase de gel a líquido-cristalino, así como la separación de fases a concentraciones elevadas del biotensioactivo. Por otra parte, el estudio de los principales grupos funcionales ha revelado un aumento tanto en el desorden de las cadenas acílicas como en la hidratación de las cabezas polares del fosfolípido. Esta sobrehidratación observada en ambas fases, gel y líquido-cristalina, es consecuencia de un cambio conformacional que causa un aumento de la exposición de estas regiones a la capa de agua intermembrana. Posteriormente, se abordó el estudio de la interacción entre diRL y la proteína transmembrana Ca2+-ATPasa de retículo sarco/endoplásmico (SERCA1a), una proteína transportadora de iones presente en las membranas de los almacenes celulares de calcio. A raíz de este trabajo hemos demostrado que la interacción con diRL provoca cambios conformacionales que inestabilizan a la enzima facilitando su desnaturalización térmica, inhibiendo también su actividad ATPasa a concentraciones por debajo del límite de solubilización de membrana. La interacción diRL-SERCA no está relacionada con su actividad superficial sino con las propiedades fisicoquímicas de esta molécula. Finalmente, se estudió el efecto de distintas condiciones de pH y temperatura sobre la estabilidad de los diferentes agregados estructurales supramoleculares del diRL. Entre los resultados de este trabajo cabe resaltar que el diRL adopta estructuras multilamelares organizadas a pH y temperaturas bajas que se ven alteradas al aumentar cualquiera de estos parámetros. Así mismo se describe una transición termotrópica endotérmica en torno a 34ºC de los agregados de diRL protonado. En su conjunto, esta tesis doctoral aporta nueva información sobre las propiedades fisicoquímicas del diRL en medio acuoso y su interacción con membranas fosfolipídicas modelo. Cada publicación, individualmente, es una contribución relevante para desvelar el complejo mecanismo por el que este biotensioactivo interacciona con las membranas biológicas a través de sus diferentes componentes estructurales.